La exploración molecular de cáscaras de huevos fósiles descubre el linaje oculto de un ave gigante extinta

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 914 (2023) Citar este artículo

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La sistemática de las aves elefante extintas de Madagascar sigue siendo controvertida debido a las grandes lagunas en el registro fósil y la mala preservación biomolecular de los especímenes esqueléticos. Aquí, un análisis molecular de cáscaras de huevos fósiles de 1000 años de antigüedad proporciona la primera descripción de la filogeografía del pájaro elefante y ofrece información sobre la ecología y la evolución de estos gigantes no voladores. Los genomas mitocondriales de todo Madagascar revelan una variación genética que se correlaciona con la morfología de la cáscara del huevo, la composición de isótopos estables y la distribución geográfica. La corona del pájaro elefante data de ca. Hace 30 millones de años, cuando se estima que Madagascar se había vuelto menos árido a medida que avanzaba hacia el norte. Los altos niveles de variación genética entre clados respaldan la reclasificación de Mullerornis en una familia separada. Los bajos niveles de variación genética dentro del clado sugieren que solo existieron dos géneros de aves elefante en el sur de Madagascar durante el Holoceno. Sin embargo, encontramos una colección de cáscaras de huevo del extremo norte de Madagascar que representa un linaje único de Aepyornis. Además, la divergencia dentro de Aepyornis coincide con la aridificación de Madagascar durante el Pleistoceno temprano ca. 1,5 Ma, y es consistente con la fragmentación de las poblaciones en las tierras altas que impulsa la diversificación y la evolución del gigantismo extremo en escalas de tiempo cortas. Abogamos por una revisión de su taxonomía que integre perspectivas paleogenómicas y paleoecológicas.

Las aves elefante de Madagascar (Aves: Aepyornithidae) eran ratites grandes y no voladoras que se extinguieron hace aproximadamente un milenio. La relación de las aves elefante con otras aves siguió siendo un misterio hasta que varios estudios genéticos descubrieron que son hermanas del kiwi de Nueva Zelanda1,2,3, revolucionando nuestra comprensión de la diversificación aviar. Sin embargo, la biodiversidad y las relaciones evolutivas dentro de las aves elefante han sido inciertas e inestables desde que fueron descritas por primera vez hace más de 150 años4, ya que la mayoría de las especies se conocen sólo a partir de unos pocos restos esqueléticos postcraneales incompletos del Pleistoceno-Holoceno del sur y centro de Madagascar5,6. 7 (Fig. 1a y Datos complementarios 1). En general, se aceptaron alrededor de ocho especies de aves elefante en dos géneros basándose en la comparación morfológica de fósiles esqueléticos4 (Fig. 1c), pero una reevaluación morfométrica reciente del material esquelético6,7 reclasificó a las aves elefante en cuatro especies en tres géneros (Aepyornis, Mullerornis y un nuevo género, Vorombe). Sin embargo, esta revisión sigue siendo cuestionable: la homoplasia en los caracteres morfológicos que ha surgido a través de la evolución convergente significa que la morfología esquelética poscraneal distingue mal los límites de las especies dentro de los taxones extintos de ratites8, así como las relaciones evolutivas entre ellos. Alternativamente, el uso de ADN antiguo (ADNa) ha demostrado ser muy exitoso en la delimitación de los límites, las relaciones filogenéticas y los rangos geográficos de las especies de aves extintas8,9,10,11,12, y la corroboración de la sistemática de las aves elefante mediante métodos moleculares es aún más difícil. desde hace mucho tiempo. Aunque el ambiente cálido y húmedo de Madagascar no es óptimo para la preservación del ADNa en los huesos13, se ha recuperado de cáscaras de huevos de aves elefante3,14, que se encuentran en abundancia, mientras que los fósiles esqueléticos son menos comunes15. Con la ayuda de la micromorfología de la cáscara de huevo, la geoquímica de isótopos estables y la paleoproteómica, aquí detallamos el primer estudio filogeográfico de aves elefante utilizando ADN mitocondrial completo de cáscara de huevo, con el fin de revisar la taxonomía y la historia evolutiva de las aves elefante. Como isla con altos niveles de endemismo, Madagascar es un sistema modelo para estudiar los mecanismos subyacentes a la evolución y la extinción, y la falta de resolución en torno a la historia de vida de las aves más grandes del mundo presenta una brecha importante en nuestra comprensión.

a Mapa de Madagascar que representa la ubicación geográfica de las muestras de cáscara de huevo recolectadas (círculos pequeños) y analizadas (círculos más grandes con un borde). Las muestras con datos genéticos están representadas por su ID# y el grosor de la muestra es proporcional al icono representado a su derecha. Se muestra la ubicación de especímenes fósiles de aepyornithids (diamantes) y mullerornithids (cuadrados) (Fig. 1c; consulte los Datos complementarios 1 para obtener datos de localidad y referencias). Las muestras para las que se disponía de datos de ADN están coloreadas en amarillo, incluidos los cuatro genomas publicados anteriormente recuperados de muestras de huesos. Los superíndices al lado de los especímenes se refieren a la literatura que publicó previamente datos genéticos de estos especímenes. Se muestra una topografía simplificada del paisaje con ríos representados por líneas finas (adaptado de https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Madagascar_rivers.svg bajo CC BY-SA 3.0, https://creativecommons.org/licenses/ by-sa/3.0/deed.en; se omiten los nombres de los ríos) y biomas representados por tonos de gris (adaptado de Brown et al.93 bajo CC BY 4.0). b La distribución del grosor de las cáscaras de los huevos se deriva del número total de cáscaras de huevos recolectadas en el norte y el sur de Madagascar. El ancho de las siluetas de la cáscara de huevo se escala para representar el espesor medio del morfotipo y se colocan sobre el eje X en el espesor medio; el ancho de las barras de colores representa dos desviaciones estándar a cada lado de la media. c Revisiones taxonómicas para aves elefante con superíndices que hacen referencia cruzada al autor original del nombre taxonómico94,95,96,97,98,99,100. Los datos de origen para esta figura se pueden encontrar en los Datos complementarios 1 a 4.

Se recolectaron más de 960 fragmentos de cáscaras de huevos de aves elefante en 291 localidades del sur, el centro y, por primera vez, el norte de Madagascar (Fig. 1a y Datos complementarios 2). 21 nuevas dataciones por radiocarbono muestran que la distribución de las cáscaras de huevo muestreadas está temporalmente limitada entre 1290 y (al menos) 6190 años antes de Cristo (Datos complementarios 3), y es contemporánea con la mayoría de los especímenes óseos fechados anteriormente de estas áreas16 (Datos complementarios 1). Además, se encuentran depósitos de cáscara de huevo cerca de depósitos esqueléticos (Fig. 1a, Datos complementarios 1), lo que indica que las cáscaras de huevo probablemente estén asociadas con los mismos taxones que se han descrito a partir de material esquelético procedente de las mismas áreas geográficas. La muestra más joven data de 1290 ± 15 años antes de Cristo, lo que sugiere que las aves elefante existían en esa época, pero pueden haberse extinguido en los siguientes cientos de años, lo que concuerda con otras estimaciones17,18. Las mediciones del espesor de la cáscara de huevo revelan tres morfotipos: en el sur, se observa una distribución bimodal de espesores, correspondiendo cada modo a morfotipos separados de cáscara de huevo: uno que tiene, en promedio, menos de 1,1 mm de espesor y otro que tiene más de tres veces como de espesor, presentando un espesor medio de 3,32 mm (Fig. 1b). Las cáscaras de huevo del norte de Madagascar representan fósiles hasta ahora no caracterizados con un espesor promedio intermedio entre los morfotipos del sur de 1,95 mm (Fig. 1b). Dos fragmentos de cáscara de huevo del centro de Madagascar también tienen un grosor intermedio. Utilizando regresiones filogenéticamente corregidas entre el espesor de la cáscara del huevo y la masa del huevo, y el espesor de la cáscara del huevo y la masa de las aves de 65 aves (Nota complementaria 9), estimamos que, en vida, la masa de los huevos más delgados habría sido en promedio 0,86 kg (σ = 0,24 kg), depositada por un ave del tamaño de un emú que pesa ~41 kg (σ = 14,83 kg). Se estima que los huevos más gruesos eran un orden de magnitud más pesados, con 10,47 kg (σ = 3,16 kg), y fueron puestos por un ave que pesaba ~1000 kg (σ = 413,53 kg). Los huevos de espesor intermedio pesaban en promedio 3,18 kg (σ = 1,01 kg) y fueron puestos por un ave que pesaba ca. 230 kg (σ = 91,25 kg; Datos complementarios 2).

Utilizando enriquecimiento por hibridación y secuenciación de alto rendimiento de ADNa extraído de cáscaras de huevo de cada morfotipo de estas regiones, recuperamos 17 casi completos (más de 14.000 pb, cobertura promedio 27X) y cuatro parciales (más de 8500 pb, cobertura promedio 3X) Genomas mitocondriales del pájaro elefante (Datos complementarios 4). Estos genomas, así como cuatro genomas de aves elefante publicados previamente derivados de especímenes esqueléticos1, 2, se utilizaron para inferir las relaciones filogenéticas entre los morfotipos esqueléticos y de cáscara de huevo (Fig. 2a). Encontramos que los haplotipos mitocondriales derivados de especímenes esqueléticos y de cáscara de huevo se agrupan en cuatro clados bien definidos que corresponden al grosor de la cáscara del huevo y la región geográfica. Con el apoyo de la micromorfología de la cáscara de huevo, las proteínas y los isótopos estables, estos datos revelan conocimientos adicionales sobre la ecología y la especiación de las aves elefante, lo que contribuye a nuestra comprensión de cómo estas aves encajan en la rica historia evolutiva de Madagascar.

un árbol filogenético mitocondrial de consenso para todas las muestras de cáscara de huevo secuenciadas aquí y los genomas publicados previamente a partir de muestras de hueso. Los nodos marcados con un asterisco tuvieron el mayor apoyo de los análisis ML y bayesianos. Los números al lado de los nodos brindan soporte de arranque de ML y probabilidad posterior bayesiana para la topología. Los nodos no marcados tenían compatibilidad con ML <70 %. Los superíndices al lado de los especímenes se refieren a la literatura que publicó previamente datos genéticos de estos especímenes. b Filogenia mitocondrial fechada para los palaeognathae generados en el árbol MCMC utilizando varios taxones representativos de aves elefante (ver también la Fig. 3 complementaria). Los nodos fósiles calibrados se indican con un símbolo de reloj y los taxones fósiles utilizados para calibrar los nodos se representan con una silueta. Las barras grises representan el 95 % de los HPD de la fecha estimada para el nodo. Los tiempos de los principales eventos geológicos y climáticos se indican en la línea de tiempo debajo del árbol. La masa del huevo está representada por siluetas ovoides cuya área es proporcional a la masa del huevo. La masa de huevos de los taxones de aves elefante en las puntas de los árboles se estimó utilizando el espesor promedio de la cáscara de huevo para cada taxón (Nota complementaria 9). El estado ancestral de la masa de huevos en los nodos internos se estimó utilizando el espesor promedio de la cáscara de huevo para cada taxón de ave elefante. Los datos de origen para esta figura se pueden encontrar en los Datos complementarios 6 y 10-11. Las siluetas han sido reproducidas de Grealy et al.3 con autorización de Elsevier.

La primera divergencia dentro del linaje del ave elefante separa todos los especímenes de cáscara de huevo de menos de 1,5 mm de espesor en un grupo monofilético con genomas de Mullerornis publicados1,2 del hueso, y todos los huevos de cáscara de más de 1,5 mm de espesor en un grupo monofilético con Aepyornis hildebrandti, A. maximus y A. maximus publicados. Genomas de titán Vorombe1,2 (Fig. 2a). Estas agrupaciones reciben el mayor apoyo estadístico tanto de los enfoques de máxima verosimilitud como de los bayesianos (Fig. 2a), y confirman que el morfotipo de cáscara de huevo delgada está asociado con el género grácil Mullerornis. La distancia genética promedio de 2 parámetros de Kimura entre estos dos clados a través de una región de código de barras de ~600 pb de la citocromo oxidasa I (COI) es más de diez veces mayor (11,9 %) que la distancia genética promedio dentro de cada clado (Figuras complementarias 2 y Datos complementarios 5). El alto nivel de divergencia entre estos clados (más del triple de la distancia genética promedio entre géneros dentro de la familia de otras ratites en 3,7%, y más del doble de la distancia genética promedio entre familias de moa) (Figura complementaria 2) sugiere fuertemente que Pertenecen a más de una familia, aunque actualmente ambas están clasificadas como Aepyornithidae. De manera análoga a la distancia genética entre el emú (familia Dromaiidae19) y el casuario (familia Casuariidae) en 12,8%, abogamos por que Mullerornis se coloque en una familia monogenérica diferente llamada “Mullerornithidae” (como lo defendió originalmente Charles Lamberton en 193420).

Si bien las proteínas suelen proporcionar menos señales filogenéticas que el ADN antiguo, secuenciamos las proteínas antiguas conservadas en la matriz de la cáscara del huevo para explorar las diferencias de aminoácidos. Secuencias parciales de proteínas de cáscara de huevo de lectina C tipo 1 y tipo 2 codificadas nuclearmente putativas21 (XCA-1, XCA-2) reconstruidas a partir de 12 especímenes de cáscara de huevo (Datos complementarios 7) respaldan una distinción a nivel familiar entre mullerornítidos y aepyornítidos, con todas las cáscaras de huevo supuestamente mullerornítidas (<1,5 mm de espesor) que tienen una histidina en el residuo 74 de la alineación XCA-1, y todas las cáscaras de huevo de aepyornítidos (>1,5 mm de espesor) que tienen una tirosina en este sitio (Figuras complementarias 4-5). Además, se observó variabilidad en las posiciones 62 (G, A) y 65 (E, D), aunque más débilmente respaldada por los datos brutos de espectrometría de masas en tándem (Figura complementaria 6). A los mullerornítidos y aepyornítidos parece que les faltan residuos encontrados en las posiciones 26 y 101 en todos los demás paleognatos, lo que respalda su relación hermana. Las secuencias de aves elefante XCA-2 (Figs. 5 y 6 complementarias) también respaldan la separación entre aepyornítidos y mullerornítidos, con dos diferencias de aminoácidos (123: A, T; 130: P, T). La estructura del pájaro elefante XCA-1 y XCA-2 coincide estrechamente con la estructura de la estrutiocalcina-1 y la estrutiocalcina-2 de avestruz, respectivamente (Figura complementaria 7). Los residuos de aminoácidos difieren principalmente en las regiones flexibles, e incluso cuando no lo hacen, la estructura secundaria no se altera, lo que sugiere que probablemente estas mutaciones no tengan importancia funcional.

Para explorar las características morfológicas de la cáscara de huevo más allá del grosor, escaneamos con micro-CT 20 cáscaras de huevo (Datos complementarios 8) que representan cada morfotipo de grosor de cada región. Se detectaron diferencias en la microestructura entre los dos clados, pero no dentro de ellos, siendo la porosidad de las cáscaras de huevo de aepyornithid significativamente mayor que la de las cáscaras de huevo de mullerornithid (p = 0,032, df = 14; Fig. 3 y Tabla complementaria 11). Esta diferencia se debe a diferencias en la densidad de los poros (p = 0,031, df = 14) en lugar del volumen de los poros (p = 0,198, df = 14; Fig. 3 y Tabla complementaria 11). Normalmente, las diferencias en las características de los poros no pueden distinguir especies, pero pueden usarse para discriminar entre órdenes paleognáticos y familias dentro de un orden22,23,24, lo que respalda aún más la idea de que los dos géneros pertenecen a familias diferentes.

a Gráfico de barras que compara la porosidad media, el 'volumen promedio por poro' (proporcional al área de los poros) y la densidad de poros media dentro del ROI examinado de cada morfotipo de cáscara de huevo. Las barras de error representan intervalos de confianza del 95% del error estándar. Las diferencias significativas (p <0,013, prueba U de Mann-Whitney bilateral con corrección de Bonferroni, Tabla complementaria 11) se indican con un asterisco. b Exploraciones micro-CT representativas de cada morfotipo de cáscara de huevo que muestran la superficie exterior y las estructuras de los poros internos. Los datos de origen para esta figura se pueden encontrar en los Datos complementarios 8 y 12.

La datación molecular estima que la divergencia entre Aepyornithidae y Mullerornithidae ocurrió aproximadamente hace 30 Ma (95% HPD 20,6–40,3 Ma; consistente con estudios recientes2,3), cerca del límite Eoceno-Oligoceno, un período de marcado enfriamiento global y recambio de fauna en el Hemisferio norte. Antes de esa época, el clima de Madagascar era mayoritariamente seco y la isla estaba dominada por bosques espinosos; a medida que Madagascar se movía hacia el norte por encima de los 30°S, y con el establecimiento de la corriente circumpolar2, las precipitaciones aumentaron y el rango de este bioma se contrajo hacia el suroeste25 mientras que los bosques húmedos del norte y secos del oeste se originaron y expandieron26. Los cambios en el paleoclima y la vegetación dominante durante esta época pueden haber impulsado la divergencia entre las dos familias de aves elefante, como se ha propuesto entre los lémures de Madagascar27.

La división de nichos entre aepyornítidos simpátricos y mullerornítidos en el sur se evidencia por las diferencias entre las firmas isotópicas de sus cáscaras de huevo. Diferencias significativas en las composiciones isotópicas estables de carbono (δ13C), nitrógeno (δ15N) y oxígeno (δ18O) tanto de la materia orgánica como de la fracción de carbonato de 130 cáscaras de huevo de mullerornítidos y aepyornítidos del sur (p <0,009, df = 149; Fig. 4; Las figuras complementarias 9 y 10, los datos complementarios 9 y la tabla complementaria 12) indican que sus dietas diferían. Aunque el δ13C se encuentra dentro de la distribución de δ13C para la vegetación de tipo C3 (árboles y arbustos) para ambas familias, el δ13C medio de la cáscara de huevo de aepyornithid del sur es estadísticamente significativamente más negativo que la cáscara de huevo de mullerornithid (Fig. 4b). Una estimación de la contribución relativa de la vegetación CAM (metabolismo del ácido crassaculiano) a la dieta del ave elefante reveló una mayor proporción en la dieta de los mullerornítidos (22,76%) en comparación con los aepyornítidos simpátricos (16,95%), en concordancia con otros estudios28,29. Valores más negativos de δ13C en el hueso en comparación con la cáscara del huevo pueden sugerir que las aves elefante se criaron durante la estación seca, ya que se espera que las plantas facultativas CAM (aquellas que cambian entre la fijación diurna (C3) y nocturna (CAM) de CO2) estén sesgadas hacia la fijación CAM. durante épocas de estrés hídrico28, lo que da como resultado valores de δ13C más positivos (observados en la cáscara del huevo). Una mayor dependencia de los mullerornítidos de las suculentas (CAM) respalda la idea de que es posible que no hayan dependido tanto como los aepyornítidos de los reservorios alimentados por agua subterránea para hidratarse durante la temporada de reproducción28, una hipótesis que explicaría los valores más positivos de δ18O observados en la cáscara de huevo de los mullerornítidos. en comparación con la cáscara de huevo de aepyornithid (Fig. 4a). Los valores de δ18O tienden a ser más negativos en los bebedores frecuentes en comparación con los animales que cubren sus necesidades de agua a través de la alimentación30. Sin embargo, la diferencia en los valores de δ18O entre aepyornítidos y mullerornítidos en el sur es muy pequeña (~1‰) y, en cambio, puede predecirse simplemente por las diferencias en el tamaño corporal, donde los taxones simpátricos más grandes tienen agua corporal que refleja más fielmente el δ18O del consumo de agua local. agua31. Además, la variabilidad dentro de los taxones también es extremadamente pequeña, lo que indica un efecto ambiental bien amortiguado (es decir, precipitación equilibrada con evapotranspiración): esto apoya la idea de que las fuentes de agua potable se reponían constantemente con agua subterránea28.

a El contenido medio de isótopos δ13OPBD. b El contenido medio de isótopos δ13CDiet y δ13NDiet de la fracción orgánica en relación con la distribución de isótopos de carbono publicada anteriormente de plantas fotosintéticas C3, CAM y C4 de cada biorregión (elipses). Las cruces de colores representan intervalos de confianza del 95% de la media para cada morfotipo. Los asteriscos indican diferencias significativas (p <0,01, prueba U de Mann-Whitney bilateral con corrección de Bonferroni, Tabla complementaria 12). Los valores medios de isótopos estables para todos los tipos de cáscara de huevo difieren significativamente de los valores de isótopos publicados previamente en el hueso de Aepyornis hildebrandti del centro de Madagascar. Los datos de origen para esta figura se pueden encontrar en Datos complementarios 9.

El δ15N medio en la cáscara de huevo de aepyornítido del sur es 4,1‰ mayor que el promedio de más de 400 plantas de esa región (Datos complementarios 9), y el δ15N se enriquece en aproximadamente un 1,5‰ entre la cáscara de huevo de aepyornítido y mullerornítido de la misma región. El nitrógeno enriquecido puede ser un indicador de estrés nutricional en las aves (como durante la puesta)32; sin embargo, si ese fuera el caso, podríamos esperar ver una diferencia significativa en δ15N entre la cáscara del huevo y el hueso, lo cual no es así. El enriquecimiento de nitrógeno también puede ser una respuesta a la aridificación y se observa en herbívoros tolerantes a la sequía que viven en hábitats xéricos33; sin embargo, no observamos nitrógeno enriquecido en mullerornítidos del mismo ambiente. Más bien, el δ15N enriquecido observado en los aepyornítidos probablemente refleja un metabolismo de nitrógeno en estado no estacionario asociado con sus huevos gigantes. Alternativamente, los aepyornítidos del sur pueden pertenecer a un nivel trófico más alto que los mullerornítidos34, complementando su dieta con insectos o incluso pequeños lagartos, o puede ser un apoyo adicional para la actividad nocturna de los aepyornítidos35, con especies nocturnas que tienen δ15N más alto en comparación con las diurnas, crepusculares, o especies catémerales30.

Nuestra evidencia genética sugiere que cada familia de aves elefante es monogenérica. Los especímenes esqueléticos de Mullerornis modestus6 (sin. M. agilis, M. betsilei, M. rudis, M. grandis) están anidados consistentemente dentro del clado Mullerornithidae junto con todos los especímenes de cáscara de huevo de <1,5 mm de espesor (Fig. 2a). Las longitudes cortas de las ramas, la divergencia estimada reciente y el escaso apoyo a la topología filogenética dentro del clado son consistentes con que todas estas muestras representan una sola especie. La distancia genética promedio por pares en COI entre especímenes de Mullerornis es 0,27% (±0,051%; Figura complementaria 2 y Datos complementarios 5), que corresponde a la cantidad promedio de variación genética dentro de las especies para todas las demás ratites en el mismo locus (0,39% ± 0,431% (Figura complementaria 2 y Datos complementarios 5). Tampoco hay evidencia de agrupamiento geográfico dentro de Mullerornis del sur, con algunas muestras del suroeste más estrechamente relacionadas con muestras del extremo sur que otras del suroeste, y viceversa (Fig. 2; valor de p = 0,135, Z = 0,27, prueba de Mantel; Nota complementaria 5). Por lo tanto, nuestros datos sugieren que hubo una especie de Mullerornis que habitó el sur durante el Holoceno tardío. Junto con análisis morfométricos recientes de fósiles esqueléticos que incluyen especímenes de Mullerornis del centro de Madagascar6, nuestros datos apoyan la noción de que Mullerornis era un género monotípico, que tenía una especie que se distribuía por todo el centro y sur de Madagascar, M. modestus; sin embargo, la cáscara de huevo de Mullerornis y los huesos del centro de Madagascar aún no se han sometido a pruebas genéticas. Las descripciones anteriores36 de numerosas especies más pequeñas de mullerornítidos en la región pueden haber sido confundidas por el dimorfismo sexual y la falta de datos de series de crecimiento, así como por variaciones temporales y geográficas en el tamaño (que se ha estimado que varía en más del 50% entre el final del Glaciar y Holoceno tardío (más de aproximadamente 25 ka) en algunas especies de moa37,38).

Dentro de Aepyornithidae, recientemente se ha sugerido que dos géneros coexistieron en el sur y el centro de Madagascar6,7: Vorombe y Aepyornis; sin embargo, no encontramos evidencia genética que respalde esta hipótesis. Si bien los datos genéticos muestran que, de hecho, hay dos clados bien respaldados (90 y 87% de apoyo de arranque) dentro de Aepyornithidae, solo un clado contiene muestras del sur de Madagascar, mientras que el otro contiene muestras del centro y norte de Madagascar. La distancia genética a través del CO1 entre estos clados es inferior al 1,01%: en comparación con otras ratites, donde la distancia genética entre géneros (dentro de la familia) oscila entre el 2,3 y el 5,1% (Figura 2 complementaria y Datos complementarios 5), la Dos clados de aepyornithid no son lo suficientemente distintos genéticamente como para ser considerados géneros diferentes. Aunque no existe un umbral de divergencia reconocido para la separación genérica, este hallazgo pone en duda la legitimidad taxonómica de la ave más grande jamás registrada, el titán Vorombe.

Además, la distancia genética promedio por pares en COI entre especímenes del clado sur (0,102%; IC del 95% ± 0,058%) es menor que la variación dentro de la especie de otras ratites (0,39% en promedio; Figura complementaria 2), lo que sugiere es poco probable que existiera más de una especie, y mucho menos un género, dentro de este clado. De hecho, las dos muestras de hueso (una identificada como probable titán Vorombe y otra como probable Aepyornis maximus, Nota complementaria 1) son genéticamente idénticas en este locus. Tampoco existe correlación dentro de este clado del sur entre la distancia genética y la ubicación geográfica (valor p = 0,093, Z = 0,31, prueba de Mantel; Nota complementaria 5), ​​y no hay diferencia genética entre la cáscara de huevo de aepyornithid de grosor medio (1,5–3 mm). y las cáscaras de huevo más gruesas (>3 mm) en el sur, con algunas cáscaras de huevo más delgadas (“medianas”) que están más estrechamente relacionadas con cáscaras de huevos más gruesas que otras cáscaras de huevos medianas, y viceversa. Las longitudes de las ramas son extremadamente cortas y la topología filogenética dentro del clado sur no está bien respaldada (Fig. 2), lo que respalda aún más la idea de que no existe una subestructura mitocondrial dentro de este clado. Tampoco se observaron diferencias en la microestructura (porosidad, volumen de poro promedio y densidad de poro; valor de p> 0,15; Fig. 4), o firma isotópica (valor de p = 0,1161, F = 2,058, n = 49, PERMANOVA) entre cáscaras de huevo de aepyornithid medianas y gruesas en el sur. Tampoco se observaron sustituciones de aminoácidos en la secuencia de la proteína de la cáscara de huevo XCA-1 entre las cáscaras de huevo de aepyornithid.

Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que o tomamos muestras solo de cáscaras de huevos pertenecientes a uno de los dos géneros de aepyornithid en el sur, o que un género no representa un grupo taxonómico válido. Teniendo en cuenta que la distribución de los fósiles esqueléticos tanto de Aepyornis como de Vorombe se superpone espacial y temporalmente con los especímenes de cáscara de huevo analizados aquí (Datos complementarios 1), es poco probable que no hayamos podido muestrear la cáscara de huevo de un taxón completo que supuestamente era simpátrico con el otro6, salvo un sesgo deposicional extremo dependiente de la taxonomía (como que un género anida en una región diferente a donde se puede encontrar la mayor concentración de sus esqueletos, o el lavado de cáscaras de huevos a la costa desde otros lugares). Sin embargo, las cáscaras de huevo de aepyornithid del sur analizadas aquí pertenecen todas a un género, el mismo género que la cáscara de huevo de Madagascar central. Debido a que la identificación de los especímenes esqueléticos del centro de Madagascar como Aepyornis hildebrandti es indiscutible, la cáscara de huevo del sur analizada aquí también pertenecería al género Aepyornis, pero a una especie separada. Sobre esta base, defendemos tentativamente la sinonimia de Vorombe6,7 con Aepyornis39 y devolver a titan40 la sinonimia con maximus39, a la espera de más pruebas de lo contrario.

En lugar de pertenecer a especies diferentes, los dos morfotipos esqueléticos de aepyornítidos observados en el sur6 pueden pertenecer a un taxón sexualmente dimórfico. Al igual que el kiwi, el pariente más cercano existente de las aves elefante1,2,3, donde las hembras pueden tener entre un 120% y un 180% del tamaño de los machos8,10, el “Aepyornis maximus” más pequeño puede ser machos y el “Titán Vorombe” más grande pueden ser hembras de la misma especie4. De hecho, varias especies de moa (Dinornis) se han consolidado en dos especies sexualmente dimórficas8,38, una de la Isla Norte (D. novaezealandiae) y otra de la Isla Sur (D. robustus). En la Isla Norte, por ejemplo, las hembras (“D. giganteus” y “D. novaezeelandiae”) tenían hasta un 280% de la masa de los machos (“D. struthoides”)8,38. En promedio, Vorombe tiene un 175% del tamaño de A. maximus, pero incluso considerando el tamaño corporal máximo estimado de Vorombe en comparación con el tamaño corporal mínimo estimado para A. maximus6, la diferencia aún cae dentro del rango (aunque extremo) de sexualidad invertida. dimorfismo observado en otras ratites.

Esta hipótesis se ve respaldada aún más por nuestro cálculo de que la masa del ave que puso una cáscara de huevo tan gruesa era aproximadamente del tamaño de Vorombe, mientras que se habría esperado que un ave del tamaño de A. maximus pusiera un huevo mucho más delgado (ver también la Nota complementaria 10); Aunque en el sur se encuentran cáscaras de huevo de grosor medio, estas también son genéticamente idénticas (Fig. 2) incluso a las cáscaras de huevo más gruesas (>4 mm) (que pueden representar huevos inviables, no fertilizados o rotos prematuramente, ya que la cáscara del huevo se vuelve más delgada a medida que crece el embrión). se desarrolla). En última instancia, se requiere la tipificación sexual para confirmar la hipótesis de que los morfotipos esqueléticos representan dimorfismo sexual dentro de las especies; sin embargo, esto implica recuperar ADN nuclear de muestras de hueso, ya que se espera que el ADN de la cáscara de huevo sea femenino (origen materno). Alternativamente, la presencia de histología ósea específica de la hembra (es decir, hueso medular en hembras grávidas) en un solo morfotipo esquelético también puede ayudar a probar la hipótesis del dimorfismo sexual en Aepyornithidae; sin embargo, hasta el momento no se ha detectado hueso medular en ningún fósil esquelético de aepyornítido41,42.

Si bien se ha recuperado ADN nuclear de la cáscara de huevo de ave elefante, se ha limitado al enriquecimiento de genes codificadores de proteínas conservados, útiles para discernir divergencias profundas3. Los avances futuros en la tecnología del ADN pueden permitir la recuperación de regiones altamente polimórficas del genoma nuclear, revelando una diversidad genética adicional o una estructura poblacional dentro de los taxones de aves elefante que no pudimos resolver solo con el ADN mitocondrial. Además, el muestreo en una mayor parte de su área de distribución (Fig. 1 y Datos complementarios 1), particularmente en el medio-noroeste (Besalampy), las tierras altas centrales, el centro-este y el sureste (Farafangana, Fort Dauphin) será esencial para Obtenga una imagen completa de la diversidad de aves elefante. De todos modos, estos resultados sugieren una menor diversidad dentro de Aepyornithidae en el sur de Madagascar de lo que se ha descrito anteriormente. Por lo tanto, la biodiversidad de las aves elefante no sólo fue menor de lo previsto a partir del registro fósil esquelético, sino que también pudo haber sido mucho menor de lo que uno podría esperar de un país grande con numerosas barreras climáticas y geográficas al flujo de genes (Fig. 1) y una de las más altas. biotas endémicas en el mundo43. Es posible que en el pasado existieran más especies en el sur de Madagascar; sin embargo, el registro de fósiles esqueléticos anteriores al Holoceno de aves elefante de esta región es escaso (Datos complementarios 1). La baja diversidad genética puede haber afectado la resiliencia de las aves elefante a cambios importantes en el medio ambiente causados ​​por el uso de la tierra por parte de los humanos a finales del Holoceno, contribuyendo a su extinción.

Cuatro mitogenomas de cáscara de huevo encontrados en el extremo norte de Madagascar los ubican sin ambigüedades en un clado monofilético hermano del clado central malgache que incluye el mitogenoma publicado de un espécimen esquelético de A. hildebrandti, así como un espécimen de cáscara de huevo de espesor comparable al de la cáscara del norte (Fig. .2a). La exclusión de especímenes de Madagascar central del clado norte con un alto nivel de confianza (y viceversa) indica que las cáscaras de huevo del norte pertenecen a una unidad única evolutivamente significativa. Aunque la distancia genética promedio en COI entre el Aepyornis del norte y el Aepyornis central es del 0,2% (dentro de los límites de la variación intraespecífica observada en las ratites; Figura complementaria 2), es poco probable que se pueda atribuir la distinción de estos dos clados recíprocamente monofiléticos. a la coalescencia aleatoria (valor de p <0,05; Nota complementaria 5 y Tabla complementaria 9), lo que puede sugerir que el clado norte representa un taxón críptico. Por otro lado, la conectividad genética entre poblaciones superpuestas de Aepyornis en todo Madagascar también podría dar como resultado un patrón de diferenciación genética en los extremos muestreados del rango geográfico, pero lo que es, en realidad, un efecto de aislamiento por distancia (IBD). La prueba de Mantel (Nota complementaria 5) muestra que la distancia genética está significativamente correlacionada con la distancia geográfica en Madagascar (valor p = 0,001, Z = 0,31); sin embargo, esta observación también es de esperarse cuando los obstáculos físicos al flujo de genes se confunden con grandes distancias geográficas. Sin embargo, no se puede descartar la EII sin un muestreo adicional de individuos entre el norte y el centro de Madagascar, suponiendo que dichas poblaciones alguna vez existieron. Otra explicación podría ser que el flujo de genes se mantiene mediante la dispersión masculina; En este escenario, el ADN mitocondrial sólo reflejaría las relaciones entre las hembras de los elefantes tal como se hereda por vía materna, lo que haría que parecieran más diferentes de lo que lo haría el genoma nuclear.

Con base en estos datos no se puede concluir si este taxón puede considerarse una especie nueva, una subespecie o simplemente una población de A. hildebrandti; sin embargo, es un linaje independiente que representa una diversidad novedosa dentro de Aepyornis. Antes de este hallazgo, A. hildebrandti tenía un rango geográfico extremadamente limitado con especímenes restringidos sólo a los sitios de mayor elevación (aprox. 1500 metros)6,44; la inclusión del clado norte dentro de A. hildebrandti ampliaría el área de distribución conocida de esta especie en casi mil kilómetros. Hasta donde sabemos, hasta ahora no se ha descrito ningún espécimen esquelético de Aepyornis en el extremo norte de Madagascar. A diferencia de A. hildebrandti (Madagascar central), cuyos valores de δ13C y δ15N reflejan una adaptación a comer una mezcla de arbustos C3 y hasta un 48% de pastos C429,44,45, la dieta de las aves elefante del norte estuvo dominada por arbustos C3 (Fig. 4b, n = 42). Sin embargo, el δ15N promedio es 6,6 ‰, aproximadamente 2 ‰ menor que la media de 42 plantas del bioma del noroeste/bosque caducifolio seco46 (Fig. 4 y Datos complementarios 9), pero 2,5 ‰ mayor que A. hildebrandti. Dos explicaciones para el agotamiento observado en el nitrógeno de la dieta podrían ser que (a) los miembros del clado norte subsistían a base de frutas, ya que los frugívoros típicamente exhiben un δ15N más bajo que los folívoros30, o (b) el δ15N típicamente se enriquece en las especies nocturnas en comparación con las especies diurnas o cateterales29 , tan similar a Mullerornis, es posible que haya estado más activo más temprano ese día. Esta ecología alimentaria única puede respaldar la designación del clado norte como una nueva especie; sin embargo, puede sugerir que A. hildebrandti era una especie generalista con la capacidad de subsistir en una variedad de ambientes. Aunque no podemos erigir un nombre formal para este nuevo linaje de pájaro elefante, la noción de que una secuencia de ADNa, de forma aislada, puede definir un taxón ha sido puesta a prueba con el descubrimiento de los homínidos de Denisova, donde el registro fósil consiste en unos pocos huesos morfológicamente indistintos con diferencias genéticas significativas con los humanos modernos47.

El morfotipo de cáscara de huevo de espesor medio del clado norte, junto con su estrecha relación con A. hildebrandti, sugiere que las aves elefante del norte probablemente tenían un cuerpo más pequeño que sus contrapartes del extremo sur, como lo son los huesos (y la cáscara de huevo) de A. hildebrandti. más pequeños que los de los aepyornítidos del sur4,6. Estimamos que el tamaño corporal del taxón del norte es de ~230 kg con una masa de huevo de ~3 kg según el grosor promedio de la cáscara del huevo de 1,95 mm. Esto es similar en tamaño a la masa corporal estimada de A. hildebrandti en 283 kg6 (o 235 kg según nuestra predicción) y, por lo tanto, se predice que ambos serán más pesados ​​que un avestruz.

Tanto el clado central como el norte son especies diferentes del clado aepyornithid del sur, ya que la distancia genética promedio a través de COI es 1,01% (IC 95% ± 0,0526%): por encima de los límites de variación dentro de la especie (en promedio 0,1%, rango 0 –0,45%), y dentro de los límites de la variación interespecífica (dentro del género) observada en ratites y otras aves11,12 (1,02–7,5%; Figura complementaria 2). También hay una sustitución de metionina por valina en la posición 58 de la alineación de la proteína XCA-2 entre las cáscaras de huevo de aepyornítidos del sur y del norte analizadas, lo que coincide con su pertenencia a taxones diferentes. Estos resultados apoyan la designación de las especies del centro/norte como A. hildebrandti y de las especies del sur como A. maximus. Curiosamente, la distancia genética entre las especies de Aepyornis es la más baja de todas las ratites; Como las aves más grandes que jamás hayan existido, esto puede ser una consecuencia de una divergencia reciente junto con bajas tasas evolutivas asociadas con la longevidad, o largos tiempos generacionales relacionados con una gran masa corporal2.

La divergencia dentro de Aepyornis corresponde con el inicio del Cuaternario; si bien este fue un período de glaciación en el hemisferio norte, el clima malgache habría sido fresco y seco48. La datación molecular estima que hay 1,22 Ma (95% HPD 0,6–1,9 Ma) que separan los clados central y norte de Aepyornis: mal adaptado para comer pastos C4 (Fig. 4b), la expansión de un valle cubierto de hierba conocido como ventana de Mandritsara (Fig. 1a) durante el Pleistoceno pueden haber aislado poblaciones adaptadas a las montañas de las tierras altas del norte en refugios forestales que mantenían condiciones mésicas, mientras que las poblaciones centrales de A. hildebrandti se adaptaron a un hábitat abierto de “pseudoestepa” del Altiplano Central35 . Se supone que tal obstáculo de aislamiento condujo a la evolución de “pares de especies” en otros nativos malgaches49 y, de hecho, el extremo norte exhibe altos niveles de microendodemismo50,51. Este momento también coincide con la diversificación de especies de pastos endémicos que se adaptan a las presiones del pastoreo, 1–7 Ma52,53. Alternativamente, las poblaciones del oeste/noroeste de Madagascar (donde también se han encontrado cáscaras de huevo) pueden haberse originado a partir de aquellas del centro de Madagascar, expandiéndose hacia ambientes de menor altitud para seguir la retirada de la vegetación C3 y adaptarse para explotar los bosques secos caducifolios. La división entre el clado sur de Aepyornis y el clado central/norte ocurre casi simultáneamente con la división entre A. hildebrandti y el clado norte en 1,4 Ma (95% HPD 0,8–2,1 Ma). Al igual que en el norte, esta divergencia podría haber sido impulsada por un valle bajo (ventana de Menaharaka) que separa las tierras altas centrales y del sur, seguido por una expansión tardía de A. maximus hacia las altitudes más bajas del sur profundo que ya estaban habitadas por mullerornítidos (Fig. 1a). El tamaño corporal extremadamente grande (alrededor de 700 a 1000 kg) en Aepyornis maximus parece ser un rasgo derivado, y se estima que las aves elefante de corona están más cerca del tamaño de Mullerornis (alrededor de 80 kg; Nota complementaria 9 y Fig. 12), y el ancestro común de Aepyornis tenía la mitad de ese tamaño (aproximadamente 400 a 500 kg) hace apenas 1,4 millones de años (Nota complementaria 9 y Fig. 12 complementaria). Es decir, el tamaño corporal de las aves del linaje que condujo a Aepyornis maximus casi se duplicó entre el Pleistoceno medio y tardío. Esto es consistente con estimaciones anteriores2, así como con la observación de que la mayoría de la megafauna evolucionó con un gran tamaño corporal en los últimos tiempos para una termorregulación más eficiente en climas más fríos54. Por tanto, los huevos más grandes del mundo son un desarrollo comparativamente reciente en la historia evolutiva del pájaro elefante. La aridez y la temperatura también podrían haber interactuado en diferentes aspectos de la fisiología del ave elefante, incluidos los rasgos morfológicos de la cáscara del huevo, como la porosidad, para impulsar la reciente y rápida radiación dentro de Aepyornis. Una vez más, el genoma nuclear de Aepyornis proporcionaría más información sobre el control genético del gigantismo y podría identificar un papel potencial del desplazamiento del carácter reproductivo en la evolución de estos rasgos.

La sistemática de las aves elefante ha sido confusa desde su descubrimiento debido a la escasez de fósiles esqueléticos de diagnóstico, y en los últimos cien años se ha encontrado poca evidencia adicional para refutar o respaldar las clasificaciones iniciales. La incapacidad de la morfología para delimitar especies donde los fósiles esqueléticos están incompletos, particularmente cuando puede haber un dimorfismo sexual extremo, complica aún más la cuestión. Sin embargo, la excelente preservación biomolecular de la cáscara de huevo fósil ha proporcionado una opción alternativa para una investigación independiente de la sistemática de las aves elefante en paralelo a la morfología esquelética. Para evitar la inflación taxonómica, es esencial asociar los morfotipos de la cáscara del huevo y el esqueleto, y la investigación presentada aquí es un importante paso adelante para resolver la compleja diversificación de algunas de las aves más grandes del mundo. La evidencia molecular derivada aquí de cáscaras de huevos fósiles respalda tres conclusiones principales: (1) Mullerornis es lo suficientemente distinto genéticamente de todos los demás taxones para ser reconocido como perteneciente a una familia separada, “Mullerornithidae”; (2) la diversidad dentro de Aepyornithidae es baja (con respecto a la divergencia mitocondrial en relación con otras ratites grandes, y en comparación con hipótesis taxonómicas anteriores basadas en la morfología esquelética), y las morfologías esqueléticas potencialmente representan un dimorfismo sexual extremo y (3) se encontró una nueva colección de cáscaras de huevos en el extremo norte de Madagascar es genéticamente distinto y representa un nuevo linaje de Aepyornis (probablemente A. hildbrandti), cuyos fósiles esqueléticos esperan ser descubiertos en espera de una búsqueda concertada. Proponemos que se necesita una revisión de la taxonomía y sistemática de las aves elefante, incorporando esta perspectiva paleogenómica. Finalmente, identificamos posibles impulsores de la especiación en las aves elefante, es decir, la expansión de los pastizales durante el Pleistoceno. Las reconstrucciones de estados ancestrales también sugieren un origen sorprendentemente reciente del gigantismo extremo en los aepyornítidos. Estos hallazgos contribuyen a nuestra comprensión de cómo vivían y funcionaban las aves elefante dentro de los ecosistemas únicos de Madagascar, y refuerzan cómo el ADN de la cáscara de huevo es una vía prometedora para estudiar la evolución y extinción de la megafauna terrestre.

No se requirió aprobación ética para realizar esta investigación; ningún ser humano ni animal vivo fue objeto de esta investigación.

El permiso local para realizar investigaciones arqueológicas fue otorgado por la Office du Maire, Commune de Befandefa y por los jefes de Fokontany de Andavadoaka, Nosy Ve, Antsaragnagnangy, Lamboara, Ampasilava y Salary. Los permisos para la exportación de materiales arqueológicos con fines de análisis de laboratorio fueron otorgados por la Secretaría General del Ministerio de Artesanía, Cultura y Patrimonio, Dirección Regional de Cultura y Patrimonio Atsimo Andrefana, Visas de Salida Número 09/ 06- MCP/SG/DRCP .AUTOMÓVIL CLUB BRITÁNICO; Número 05/14-MACP/SG/DRCP.AA; Número 08/14- MACP/SG/DRCP.AA de acuerdo con el Dictamen Número 375, 02/02/1978. El permiso para importar fósiles a Australia se concedió mediante el permiso de importación IP15012450.

Se recolectaron especímenes de cáscara de huevo (Nota complementaria 1 y Datos complementarios 2) durante varias temporadas de campo en varios lugares del norte, sur y suroeste de Madagascar (Fig. 1) y se almacenaron a temperatura ambiente. El espesor promedio de cada muestra de cáscara de huevo se calculó como la media de los espesores de los cuatro lados medidos con un calibrador digital (Nota complementaria 2). Se midió el espesor de 197 cáscaras de huevos de aves elefante recolectadas en el norte, 512 cáscaras de huevos recolectadas al azar del suroeste y 241 cáscaras de huevos recolectadas del sur de Madagascar (Fig. 1) para examinar la distribución del espesor de las cáscaras de huevos de cada región. Las estadísticas resumidas para estas distribuciones se calcularon en PAST v3.1155.

Las muestras de cáscara de huevo para la datación por radiocarbono (Nota complementaria 3 y Datos complementarios 3) se limpiaron mecánicamente y luego se redujeron en un 50 % con la adición estequiométrica de HCl 2 N al vacío. Los fragmentos limpios se convirtieron en grafito en el Laboratorio INSTAAR para la Preparación e Investigación de Radiocarbono AMS (NSRL) antes de la medición mediante espectrometría de masas con acelerador en el Laboratorio AMS del Ciclo del Carbono Keck en la UC Irvine (KCCAMS). Las edades de radiocarbono convencionales se han calibrado utilizando CALIB v.7.1 y SHcal1356,57,58. La muestra AD1739 fue encontrada en un depósito arqueológico por KD; Las cáscaras de huevo del mismo contexto fueron datadas con radiocarbono como se indica arriba.

La proporción de dos enantiómeros (A/I), el aminoácido proteico L-isoleucina y el diastereómero no proteico d-aloisoleucina, se midió en la cáscara de huevo mediante cromatografía líquida de alta presión de intercambio iónico (Nota complementaria 4); A/I refleja el tiempo y la historia térmica integrada experimentada por la muestra. El control de calidad se controla con un estándar de laboratorio, ILC-G59; Los análisis 383A/I del estándar ILC-G en el laboratorio promedian 0,457 ± 0,012.

Se tomaron imágenes de 20 muestras de cáscara de huevo de diferentes espesores en cada ubicación mediante microtomografía computarizada (Skyscan 1175 micro-CT, Bruker-microCT) en el Centro de Microscopía, Caracterización y Análisis de la Universidad de Australia Occidental (Nota complementaria 7, Datos complementarios 8) ; Nota: tenga en cuenta que no todas las cáscaras de huevo de las que se tomaron imágenes produjeron ADN y algunas cáscaras de huevo que produjeron ADN no dejaron suficiente muestra para tomar imágenes). Los análisis se realizaron en un corte central para minimizar los efectos de los artefactos de imagen y la posible erosión de los poros cercanos a las superficies de la cáscara del huevo. Para cada muestra, se realizaron análisis 2D de la densidad de los poros y el área de los poros en una región de interés (ROI; figura complementaria 8) de 20,07 mm2 en el corte central, junto con análisis 3D del volumen de los poros y el porcentaje de porosidad en 100 cortes que abarcan aproximadamente 1 mm. de longitud alrededor del corte central, utilizando el software Bruker CTAn v1.16.4.1 + (SkyScan 2003–2011, Bruker microCT 2012–2016). Las imágenes de la superficie exterior, interior y de la estructura de los poros se representaron en Bruker CTAn y se visualizaron en FEI Avizo Fire v8.1.1 (Konrad-Zeuse-Zentrum Berlin 1995–2014; FEI, SAS 1999–2014; Nota complementaria 7). En PAST v3.1.155 se realizaron ANOVA unidireccional y pruebas t de Student por pares con una corrección de Bonferroni para comparar la densidad de poros, el volumen de poros promedio y el porcentaje de porosidad entre morfotipos de cáscara de huevo (Tabla complementaria 11). Se excluyeron de estos análisis los valores atípicos (normalmente muestras que presentan artefactos de imagen incluso después de la eliminación de ruido).

Se extrajo ADN antiguo de 33 muestras de cáscara de huevo en cada espesor de cada ubicación (norte, sur y suroeste; Fig. 1 y Datos complementarios 4). Las muestras se priorizaron para la extracción de ADN en función de su relación A/I, prefiriéndose valores bajos de A/I, así como de su exposición al medio ambiente en el momento de la recolección, priorizándose las que se encontraron enterradas. No se tomaron muestras de ADN de la misma localidad dos veces para minimizar la posibilidad de que dos muestras pudieran provenir del mismo huevo o de la misma hembra. Se extrajo ADN antiguo de 200 mg de polvo de cáscara de huevo por muestra en el Trace Advanced Ultra-Clean Environment (TrACE) de la Universidad de Curtin, WA (Australia) entre 2015 y 2018, siguiendo el protocolo descrito por Dabney et al.60 con cambios menores ( Nota complementaria 5), ​​y de acuerdo con la práctica estándar de ADNa61,62. Las bibliotecas de secuenciación Shotgun se prepararon siguiendo el protocolo descrito por Gansauge y Meyer63 con cambios menores (Nota complementaria 5 y Tabla complementaria 1-3).

Se diseñaron 3083 cebos mitocondriales de 80 unidades con mosaico 4X (20 pb) basándose en una secuencia de consenso de dos genomas de referencia publicados de Aepyornis1,2 (n.º de acceso al NCBI KJ749824 y n.º AP014697, respectivamente) y un genoma de referencia de Mullerornis1 (n.º de acceso al NCBI). KJ749825), y fueron fabricados a través de MYcroarray. El enriquecimiento por hibridación del ADN mitocondrial se realizó siguiendo el protocolo MYbaits (MYcroarray) (v.3, 2015) según las instrucciones del fabricante, con cambios menores (Nota complementaria 5).

Las bibliotecas enriquecidas se cuantificaron utilizando un LabChip GX Touch HT (Perkin Elmer) siguiendo las instrucciones del fabricante (Nota complementaria 5) y se combinaron en concentraciones equimolares en un volumen total de 60 µl. Para eliminar el dímero del cebador de bajo peso molecular y los artefactos de creación/captura de la biblioteca, se seleccionaron fragmentos de entre 140 pb y 300 pb de la biblioteca agrupada utilizando dos carriles de un casete eGel de Pippin Prep (Sage Science) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los dos carriles de la biblioteca de tamaño seleccionado se recombinaron, se purificaron y concentraron mediante un kit de purificación por PCR QIAGEN, siguiendo las instrucciones del fabricante, con cambios menores (Nota complementaria 5). La biblioteca de secuenciación final se cuantificó nuevamente en el LabChip GX Touch HT. La biblioteca se diluyó a 4 nM en agua ultrapura y se secuenció utilizando la plataforma de alto rendimiento NextSeq de Illumina, siguiendo las instrucciones del fabricante con cambios menores (Nota complementaria 5).

Las secuencias se recortaron utilizando USEARCH v.864 y las secuencias de menos de 30 pb de longitud se descartaron, ya que no se pudieron asignar de manera significativa a genomas de referencia. USEARCH v.8 se utilizó para filtrar secuencias de calidad (empleando una tasa de error esperada del 1% de la longitud de la secuencia), encontrar secuencias únicas y eliminar secuencias quiméricas (Nota complementaria 5 y Datos complementarios 4).

Para cada muestra, las secuencias se mapearon iterativamente contra un genoma mitocondrial de referencia de ave elefante de consenso en Geneious v.8.1.665 utilizando los parámetros predeterminados en una opción de "sensibilidad media-baja" con 10 iteraciones. Luego, las lecturas mapeadas se alinearon con la base de datos de referencia GenBank del NCBI66 utilizando BLAST 2.2.30+67 implementado a través de las instalaciones de supercomputación del Centro Pawsey para obtener asignaciones taxonómicas para las secuencias. Los parámetros del algoritmo blastn evocados fueron los descritos por Grealy et al.3. La taxonomía de secuencia se evaluó en MEGAN v.4.70.468 (Nota complementaria 5). Para eliminar posibles secuencias contaminantes, las lecturas que mejor se alineaban con los genomas de referencia de las aves se reasignaron al genoma de consenso generado en la última ronda de mapeo, como antes. Se generó una secuencia final de consenso estricto con un 50% de llamadas basadas en la mayoría, con posiciones que tenían una cobertura de <2 denominadas como una 'N' y posiciones sin datos representadas por '?'. Estos genomas mitocondriales finales se pueden encontrar en GenBank (Accesiones OP413790 - OP413810) o descargarse de DataDryad (https://doi.org/10.5061/dryad.3j9kd51nc). La autenticidad de las lecturas mapeadas se evaluó trazando la frecuencia de sustituciones de nucleótidos entre lecturas en mapDamage 2.0.669,70 (Figura complementaria 1 y Nota complementaria 5).

Se alinearon 20 genomas mitocondriales de aves elefante con dos genomas mitocondriales de aves elefante publicados previamente1,2 y ocho ratites de grupos externos (Tabla complementaria 4) usando MAFFT v. 7.30871 y MUSCLE v3.8.42572 implementado en Geneious v.8.1.665 usando los parámetros predeterminados ( Nota complementaria 5). Todos los genes codificadores de proteínas, ARNr y ARNt, así como la región de control, se extrajeron de la alineación y se dividieron por posición de codón (genes codificadores de proteínas) y bucles y tallos (genes de ARN). Las pruebas de RCV y de tallos73 se realizaron en PAUP v4a15074 como se describió anteriormente3, con cambios menores (Nota complementaria 5 y Tabla complementaria 5-7). Estas pruebas se utilizaron para evaluar el sesgo de composición de bases y el grado de erosión de la señal filogenética para determinar qué particiones pueden beneficiarse de la codificación RY que aliviará los sesgos; sin embargo, ninguno se beneficiaría (Nota complementaria 5). El modelo de sustitución que mejor se ajusta para cada partición se determinó utilizando jModelTest v.3.775,76 (Nota complementaria 5 y Tabla complementaria 8). Los árboles filogenéticos mitocondriales se construyeron a partir de datos codificados de nucleótidos estándar, utilizando enfoques bayesianos y de máxima verosimilitud implementados en RAxML v.1.577 y MrBayes v.3.2.678 (ejecutados a través del kit de herramientas bioinformáticas en línea CIPRES v.3.379), respectivamente (Nota complementaria 5). . Se utilizó Tracer v1.6.1 para examinar la convergencia de ejecuciones bayesianas80.

Para determinar si los clados identificados mediante análisis filogenético podrían representar especies diferentes, se calculó la distancia genética dentro y entre especímenes de aves elefante de cada región que exhiben menos del 10% de datos faltantes en 596 pb de citocromo oxidasa I (COI) en MEGA v.6.0681 utilizando el modelo de 2 parámetros de Kimura82 con eliminación por pares de los datos faltantes junto con los parámetros predeterminados para las opciones restantes (Nota complementaria 5). Para medir los límites de la variación intra e interespecífica en esta región de códigos de barras, también se estimó de la misma manera la distancia dentro y entre los géneros de moa, ñandú, emú, casuario y kiwi utilizando secuencias publicadas (Datos complementarios 5 y Suplementarios). Figura 2). El análisis de delimitación de especies83 también se realizó utilizando el complemento (v.1.03) disponible en Geneious v. 10.0.565 (Nota complementaria 5 y Tabla complementaria 9). Las pruebas de Mantel que comparan las matrices de distancia geográfica y genética se realizaron en R v1.3.109384.

La datación molecular se realizó utilizando MCMCTree85 implementado en PAML v. 4.4d86 como se describió anteriormente3 con cambios menores (Nota complementaria 5 y Datos complementarios 6), incluidas solo las mejores muestras representativas de aves elefante de cada clado e incorporando datos nucleares publicados previamente3. Se utilizaron nueve edades anteriores basadas en fósiles para la calibración (Nota complementaria 5 y Tabla complementaria 10).

La extracción de proteínas siguió protocolos publicados para análisis proteómicos de cáscaras de huevos de avestruz87 en el laboratorio de Arqueobiómica de la Universidad de Turín (Italia), con proteínas digeridas utilizando tripsina y elastasa (Nota complementaria 6). Los péptidos eluidos y secados se recibieron en el Centro Novo Nordisk para la Investigación de Proteínas (Copenhague, Dinamarca). Las muestras se separaron en una columna de 15 cm (75 μm de diámetro interior) extraída con láser interna y empaquetada con perlas C18 de 1,9 μm (Dr. Maisch, Alemania) en un EASY-nLC 1200 (Thermo Fischer Scientific, Bremen, Alemania) conectado a un Q-Exactive HF-X (Thermo Fischer Scientific, Bremen, Alemania) en un gradiente de 77 min. Los archivos .raw resultantes se buscaron utilizando PEAKS v.8.588. La tolerancia de masa del ion original y del ion fragmentado se estableció en 10 ppm y 0,05 Da respectivamente, con digestión inespecífica. La desamidación de N y Q, así como la oxidación de M, H y W se establecieron como PTM variables. Los archivos se buscaron en todas las secuencias de proteínas XCA-1 y XCA-2 disponibles21 y en el Repositorio común de proteínas adventicias (cRAP) para identificar contaminantes comunes. Los conjuntos de datos de proteómica se han depositado en el Consorcio ProteomeXchange a través del repositorio de socios de la Base de datos de identificaciones de proteómica (PRIDE) con el identificador de conjunto de datos PXD035725.

Se prepararon muestras de cáscara de huevo y vegetación (Datos complementarios 9) para el análisis isotópico siguiendo los procedimientos descritos en Miller et al.89 (Nota complementaria 8). δ13C, δ15N y δ18O se determinaron utilizando un analizador elemental (NC 2500; CE Elantech, Lakewood, Nueva Jersey) interconectado con espectrómetros de masas Thermo Finnigan (San José, CA) Delta Plus XL o Delta V Plus (Carnegie Institution of Washington, Washington, DC). ) (Nota complementaria 8). También se incluyeron datos isotópicos de Hansford y Turvey6. Los valores de isótopos estables se corrigieron según el enriquecimiento de fuentes dietéticas y las diferencias en el CO2 atmosférico (Nota complementaria 8). Se utilizó ISOERROR v1.0490 para calcular la contribución relativa de la vegetación C3 y CAM a la dieta utilizando valores fuente de δ13C de Crowley et al.46 y 127 plantas nuevas recolectadas en el suroeste de Madagascar.

Se utilizó el espesor de la cáscara del huevo, la masa del huevo y la masa del ave de 65 aves91 para producir regresiones filogenéticamente corregidas (Nota complementaria 9). Las estimaciones del estado ancestral para el grosor de la cáscara del huevo, la masa del huevo y la masa corporal se realizaron utilizando contMap92 dentro del paquete phytools (v1.2-0) en R v.4.2.084 utilizando referencias para la masa del huevo y el grosor de la cáscara del huevo para especies de paleognath (detalladas en Nota complementaria 9 y Código complementario 1).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los métodos y datos complementarios relacionados con este artículo se pueden encontrar junto con la versión en línea del artículo y en DataDryad (https://doi.org/10.5061/dryad.3j9kd51nc). Los datos de origen de las Figs. 1, 2, 3 y 4 se pueden encontrar en los Datos complementarios 1–4, 6 y 10–11, 8 y 12 y 9. Las secuencias del genoma mitocondrial de los especímenes estudiados se pueden encontrar en GenBank (ncbi.nlm.nih.gov ; accesiones OP413790, OP413791, OP413792, OP413793, OP413794, OP413795, OP413796, OP413797, OP413798, OP413799, OP413800, OP413801, OP413802, OP413803, OP41380 4, OP413805, OP413806, OP413807, OP413808, OP413809, OP413810, KJ749824, KJ749825, AP014697, AP014698). Los datos de lectura breve se han depositado en el Archivo de lectura breve del NCBI (BioProject ID PRJNA880433). Los datos de proteómica se han depositado en ProteomeXchange con el identificador de conjunto de datos PXD035725. Los especímenes de cáscara de huevo se encuentran actualmente en la Universidad de Colorado (Boulder) y la Universidad Curtin (Australia Occidental) y serán donados al Museo de la Universidad de Colorado en 2023; Mientras tanto, las solicitudes de material fósil deben dirigirse a GM Correspondence y las solicitudes de otros materiales deben dirigirse a AG.

El código utilizado para la reconstrucción del estado ancestral se puede encontrar en el Código complementario 1 y también se ha depositado en DataDryad (https://doi.org/10.5061/dryad.3j9kd51nc).

Mitchell, K. y col. El ADN antiguo revela que las aves elefante y el kiwi son taxones hermanos y aclara la evolución de las aves ratitas. Ciencia 344, 898–900 (2014).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Yonezawa, T. y col. La filogenómica y morfología de paleognatos extintos revelan el origen y evolución de las ratites. actual. Biol. 27, 1-10 (2016).

Google Académico

Grealy, A. et al. Paleogenómica de la cáscara de huevo: historia evolutiva del paleognato revelada a través del antiguo ADN nuclear y mitocondrial de la cáscara de huevo del pájaro elefante de Madagascar (Aepyornis sp.). Mol. Filogenet. Evolución. 109, 151-163 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hume, JP y Walters, M. Aves extintas (Bloomsbury Publishing, 2012).

Balanoff, AR & Rowe, T. Descripción osteológica de un esqueleto embrionario del ave elefante extinta, Aepyornis (Palaeognathae: Ratitae). Soc. Vértebra. Paleontol. Memoria. 9, 1–53 (2007).

Google Académico

Hansford, JP & Turvey, ST Diversidad inesperada dentro de las aves elefante extintas (Aves: Aepyornithidae) y una nueva identidad para el ave más grande del mundo. R. Soc. Abierto. Ciencia. 5, 181295 (2018).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hansford, JP & Turvey, ST Corrección a 'Diversidad inesperada dentro de las aves elefante extintas (Aves: Aepyornithidae) y una nueva identidad para el ave más grande del mundo'. R. Soc. Abierto. Ciencia. 5, 181295 (2020).

ADS del artículo Google Scholar

Bunce, M. y col. Dimorfismo de tamaño sexual invertido extremo en el extinto moa Dinornis de Nueva Zelanda. Naturaleza 425, 172-175 (2003).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Mitchell, KJ y cols. El antiguo genoma mitocondrial revela una afinidad taxonómica insospechada del extinto pato Chatham (Pachyanas chathamica) y resuelve los tiempos de divergencia para las cercetas marrones de Nueva Zelanda y subantárticas. Mol. Filogenet. Evolución. 70, 420–428 (2014).

Artículo PubMed Google Scholar

Huynen, L. y col. Secuencias de ADN nuclear detectan límites de especies en moa antiguos. Naturaleza 425, 175-178 (2003).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Huynen, L. y col. Estado de especie complejo para los moa extintos (Aves: Dinornithiformes) del género Euryapteryx. PLos ONE 9, e90212 (2014).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lambert, D. y col. ¿Es posible realizar un inventario de vida antigua a gran escala basado en el ADN? J. Hered. 96, 279–284 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Grealy, A. et al. El ADN antiguo tropical procedente de huesos de pescado arqueológicos a granel revela las prácticas de subsistencia de una comunidad costera histórica en el suroeste de Madagascar. J. Arqueol. Ciencia. 75, 82–88 (2016).

Artículo CAS Google Scholar

Oskam, CL y cols. La cáscara de huevo de ave fósil conserva ADN antiguo. Proc. R. Soc. B-Biol. Ciencia. 277, 1991-2000 (2010).

Artículo CAS Google Scholar

Dewar, R. en Extinciones cuaternarias: una revolución prehistórica (University of Arizona Press, 1984).

Turvey, ST Extinciones del Holoceno (Oxford University Press, 2009)

Hansford, JP, Lister, AM, Weston, EM y Turvey, ST La extinción simultánea de los megaherbívoros de Madagascar se correlaciona con la transformación del paisaje causada por el hombre en el Holoceno tardío. Cuat. Ciencia. Rev.263, 106996 (2021).

Artículo de Google Scholar

Tovondrafale, T. et al. Análisis paleoecológico de restos de aves elefante (Aepyornithidae) de la formación del Pleistoceno tardío y Holoceno del sur de Madagascar. Naturaleza malgache 8, 1-13 (2014).

Gill F, Donsker, D. & Rasmussen, P. Lista mundial de aves del COI (v 5.4) (2015).

Lamberton, C. Ratitas subfósiles de Madagascar. Los Mullerornithidae. m.ém. Acad.émy malgache 17, 125-168 (1934).

Google Académico

Demarchi, B. et al. Las proteínas antiguas resuelven la controversia sobre la identidad de la cáscara del huevo de Genyornis. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 119, e2109326119 (2022).

Tullett, SG La porosidad de las cáscaras de huevos de aves. comp. Bioquímica. Fisiol. Parte A-Physiol. 78, 5-13 (1984).

Artículo de Google Scholar

Tyler, C. y Simkiss, K. 1959 Un estudio de las cáscaras de huevos de aves ratites. Proc. Zoológico. Soc. Londres. 133, 201 (1959).

Artículo de Google Scholar

Grellet-Tinner, G. Interpretación filogenética de huevos y cáscaras de huevo: implicaciones para la filogenia de Palaeognathae. Alcheringa 30, 141–182 (2006).

Artículo de Google Scholar

Yoder, AD y Nowak, MD ¿Ha sido la vicariancia o la dispersión la fuerza biogeográfica prominente en Madagascar? Sólo el tiempo dirá. Año. Rev. Ecológico. Evolución. Sistema. 37, 405–431 (2006).

Artículo de Google Scholar

Buerki, S., Devey, DS, Callmander, MW, Phillipson, PB & Forest, F. Historia espacio-temporal de los géneros endémicos de Madagascar. Bot. J. Linn. Soc. 171, 304–329 (2013).

Artículo de Google Scholar

Yoder, AD y Yang, Z. Fechas de divergencia para lémures malgaches estimadas a partir de múltiples loci genéticos: contexto geológico y evolutivo. Mol. Ecológico. 13, 757–773 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Clarke, SJ, Miller, GH, Fogel, ML, Chivas, AR y Murray-Wallace, CV La biogeoquímica de aminoácidos e isótopos estables de las cáscaras de huevos del pájaro elefante (Aepyornis) del sur de Madagascar. Cuat. Ciencia. Rev. 25, 2343–2356 (2006).

ADS del artículo Google Scholar

Hansford, JP & Turvey, ST Los isótopos dietéticos de la megafauna extinta de Madagascar revelan gremios de ramoneo y pastoreo del Holoceno. Biol. Letón. 18, 20220094 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Crowley, BE, Melin, AD, Yeakel, JD y Dominy, NJ ¿Los valores de isótopos de oxígeno en el colágeno reflejan la ecología y fisiología de los mamíferos neotropicales? Frente. Ecológico. Evolución. https://doi.org/10.3389/fevo.2015.00127 (2015).

Bryant, JD & Froelich, PN Un modelo de fraccionamiento de isótopos de oxígeno en el agua corporal de grandes mamíferos. Geochim. Cosmochim. Acta 59, 4523–4537 (1995).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Hobson, KA, Alisauskas, RT y Clark, RG Enriquecimiento de isótopos de nitrógeno estable en tejidos de aves debido al ayuno y al estrés nutricional: implicaciones para los análisis isotópicos de la dieta. Cóndor 95, 388–394 (1993).

Artículo de Google Scholar

Kelly, JF 2000 Isótopos estables de carbono y nitrógeno en el estudio de la ecología trófica de aves y mamíferos. Poder. J. Zool. 78, 1–27 (2000).

Artículo de Google Scholar

Vanderklift, MA y Ponsard, S. Fuentes de variación en el enriquecimiento de δ15N en la dieta del consumidor: un metanálisis. Ecología 136, 169–182 (2003).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Torres, CR & Clarke, JA Gigantes nocturnos: evolución de la ecología sensorial en aves elefante y otros paleognatos inferidos a partir de reconstrucciones cerebrales digitales. Proc. R. Soc. B. 285, 20181540 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Brodkorb, P. Catálogo de aves fósiles. Boletín del Museo del Estado de Florida (Universidad de Florida, 1963).

Worthy, TH Dimorfismo sexual y variación temporal en las especies de moa de la Isla Norte Euryapteryx curtus (Owen) y Pachyornis mappini Archey. Nacional Mus. Rec. de Nueva Zelanda 3, 59–70 (1987).

Google Académico

Worthy, TH, Bunce, M., Cooper, A. y Scofield, P. Dinornis: una rareza insular, un enigma taxonómico revisado. Alcover, JA y Bover, P. (eds.), Actas del Simposio Internacional “Evolución de los vertebrados insulares: el enfoque paleontológico” Monographies de la Societat d'Historia Natural de les Balears 12, 337–390 (2005).

Geoffroy Saint-Hilaire, I. Nota sobre los huesos en Madagascar; en aluviones modernos; y procedente de un gigantesco Bird.CR Hebd. Sesión Acad. Ciencia. París 32, 101-107 (1851).

Google Académico

Andrews, CW Una nueva especie de Aepyornis (AE. titan). Geol. revista 1, 18-20 (1894).

ADS del artículo Google Scholar

Chinsamy, A., Angst, D., Canoville, A. & Gölich, UB La histología ósea proporciona información sobre la biología de las aves elefante extintas (Aepyornithidae) de Madagascar. Biol. J. Linn. Soc. 130, 268–295 (2020).

Artículo de Google Scholar

de Ricqlès, A., Bourdon, E., Legendre, LJ & Cubo, J. Evaluación preliminar de la histología ósea en el ave elefante extinta Aepyornis (Aves, Palaeognathae) de Madagascar. CR Paleovol 15, 197–208.

Artículo de Google Scholar

Wilmé, L. et al. Evolución biogeográfica de la biota microendémica de Madagascar. Ciencia 312, 1063–1065 (2006).

Samonds, KE y cols. Un nuevo sitio subfósil del Pleistoceno tardío (Tsaramody, cuenca de Sambaina, Madagascar central) con implicaciones para la cronología del hábitat y el cambio de la comunidad de megafauna en las tierras altas centrales de Madagascar. J. Quat. Ciencia. 34, 379–392 (2019).

Artículo de Google Scholar

Crowley, BE, Godfrey, LR, Hansford, JP & Samonds, KE Ver el bosque por los árboles y los pastos: revisando la evidencia de pastizales mantenidos por pastores en las tierras altas centrales de Madagascar. Proc. R. Soc. B. 288, 20201785 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Crowley, BE y cols. Explicando la variación geográfica en la composición isotópica de los lémures ratón (Microcebus). J. Biogeogr. 38, 2106-2121 (2011).

Artículo de Google Scholar

Krause, J. y col. El genoma completo del ADN mitocondrial de un homínido desconocido del sur de Siberia. Naturaleza 464, 894–897 (2010).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

deMenocal, PB Clima africano plio-pleistoceno. Ciencia 270, 53–58 (1995).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Goodman, S. y col. Una nueva especie de roedor del bosque montano del centro este de Madagascar (Muridae: Nesomyinae: Voalavo). Proc. Biol. Soc. Washington 118, 863–873 (2005).

Artículo de Google Scholar

Pearson, RG y Raxworthy, CJ La evolución del endemismo local en Madagascar: hipótesis de cuenca hidrográfica versus gradiente climático evaluadas mediante modelos biogeográficos nulos. Evolución 63, 959–967 (2009).

Artículo PubMed Google Scholar

Everson, KM, Jansa, SA, Goodman, SM & Olson, LE 2020. Las regiones montañosas dan forma a patrones de diversificación en pequeños mamíferos y reptiles del bosque húmedo siempre verde de Madagascar. J. Biogeogr. 47, 2059-2072 (2020).

Artículo de Google Scholar

Solofondranohatra, CL et al. Los pastizales determinados por el fuego y el pastoreo del centro de Madagascar representan conjuntos antiguos. Proc. R. Soc. B 287, 20200598 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Hackel, J. y col. Diversificación de pastos en Madagascar: radiación in situ de dos grandes clados de sombra C3 y apoyo a un origen del Mioceno al Plioceno de biomas herbáceos C4. J. Biogeogr. 45, 750–761 (2018).

Artículo de Google Scholar

Crouch, NMA y Clarke, JA La evolución del tamaño corporal en aves paleognatas es consistente con el gigantismo neógeno ligado al enfriamiento. Paleogeogr. Paleoclimatol. Paleeco. https://doi.org/10.1016/j.palaeo.2019.05.046 (2019).

Martillo, Ø. et al. PAST: paquete de software de estadística paleontológica para educación y análisis de datos. Paleontol. Electrón. 4, 9 (2001).

Google Académico

Hogg, A. y col. SHCAL13 Calibración del hemisferio sur, 0-50.000 años cal BP. Radiocarbono 55, 1-15 (2013).

Artículo de Google Scholar

Stuiver, M. & Reimer, PJ Base de datos extendida de 14C y programa de calibración de edad CALIB 3.0 14C revisado. Radiocarbono 35, 215–230 (1993).

Artículo de Google Scholar

CALIB rev. 5; Stuiver, M. y Reimer, PJ Radiocarbon 35, 215–230 (1993).

Wehmiller, J. Comparación entre laboratorios de proporciones enantioméricas de aminoácidos en fósiles del Pleistoceno. Cuat. Geocronol. 16, 173–182 (2013).

Artículo de Google Scholar

Dabney, J. y col. Genomas mitocondriales completos de un oso de las cavernas del Pleistoceno medio reconstruidos a partir de fragmentos de ADN ultracortos. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 110, 15758–15763 (2013).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Willerslev, E. y Cooper, A. ADN antiguo. Proc. R. Soc. B-Biol. Ciencia. 272, 3–16 (2005).

Artículo CAS Google Scholar

Knapp, M. y col. Preparando el escenario: construir y trabajar en un antiguo laboratorio de ADN. Ana. Anat.-Anat. Anz. 194, 3–6 (2012).

Artículo CAS Google Scholar

Gansauge, MT & Meyer, M. Preparación de una biblioteca de ADN monocatenario para la secuenciación de ADN antiguo o dañado. Nat. Protocolo. 8, 737–748 (2013).

Artículo PubMed Google Scholar

Edgar, RC Búsqueda y agrupación de órdenes de magnitud más rápido que BLAST. Bioinformática 26, 2460–2461 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kearse, M. y col. Geneious Basic: una plataforma de software de escritorio extensible integrada para la organización y análisis de datos de secuencia. Bioinformática 28, 1647-1649 (2012).

Benson, DA y cols. GenBank. Ácidos nucleicos res. 34, D16-D20 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Altschul, S. y col. Herramienta básica de búsqueda de alineación local. J. Mol. Biol. 215, 403–410 (1990).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Huson, D. y col. Análisis MEGAN de datos metagenómicos. Genoma Res. 17, 377–386 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ginolhac, A. et al. mapDamage: pruebas de patrones de daño en secuencias de ADN antiguas. Bioinformática 27, 2153–2155 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Jonsson, H. y col. mapDamage2.0: estimaciones bayesianas aproximadas rápidas de parámetros de daño al ADN antiguo. Bioinformática 29, 1682-1684 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Katoh, K. y col. MAFFT: un método novedoso para el alineamiento rápido de múltiples secuencias basado en la transformada rápida de Fourier. Ácidos nucleicos res. 30, 3059–3066 (2002).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Edgar, R, C. MUSCLE: alineación de secuencias múltiples con alta precisión y alto rendimiento. Ácidos nucleicos res. 32, 1792-1797 (2004).

Artículo PubMed Google Scholar

Phillips, M. y col. Relaciones a nivel familiar entre los “herbívoros” marsupiales de Australasia (Diprotodontia: koala, wombats, canguros y zarigüeyas). Mol. Filogenet. Evolución. 46, 594–605 (2008).

Artículo PubMed Google Scholar

Swofford, DL PAUP* v. 4.0b (Sinauer Associates, Sunderland, 2003).

Guindon, S. & Gascuel, O. Un método simple, rápido y preciso para estimar grandes filogenias por máxima verosimilitud. Sistema. Biol. 52, 696–704 (2003).

Artículo PubMed Google Scholar

Darriba, D. et al. jModelTest 2: más modelos, nuevas heurísticas y computación paralela. Nat. Métodos 9, 772 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stamatakis, A. RAxML Versión 8: una herramienta para el análisis filogenético y el posanálisis de grandes filogenias. Bioinformática 30, 1312-1313 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huelsenbeck, JP & Ronquist, F. MrBayes: Inferencia bayesiana de árboles filogenéticos. Bioinformática 17, 754–755 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Miller, M. y col. Creación del CIPRES Science Gateway para la inferencia de grandes árboles filogenéticos. Actas del Taller sobre entornos informáticos de puerta de enlace (GCE), 1–8 (2010).

Rambaut et al. Tracer: Herramienta de análisis de seguimiento MCMC v. 1.6.1pre (2003).

Kumar, S., Stecher, G., Li, M., Knyaz, C. y Tamura, K. MEGA X: Análisis genético evolutivo molecular en plataformas informáticas. Mol. Biol. Evolución. 35, 1547-1549 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kimura, M. Un método simple para estimar la tasa evolutiva de sustituciones de bases mediante estudios comparativos de secuencias de nucleótidos. J. Mol. Evolución. 16, 111-120 (1980).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Masters, B., Fan, V. y Ross, H. Delimitación de especies: un complemento generoso para la exploración de los límites de las especies. Mol. Ecológico. Recurso. 11, 154-157 (2010).

Artículo de Google Scholar

Equipo central de R. R: lenguaje y entorno para la informática estadística. https://www.R-project.org/ (Fundación R para Computación Estadística, 2020).

Yang, Z. y col. Estimación bayesiana de los tiempos de divergencia de especies bajo un reloj molecular utilizando múltiples calibraciones de fósiles con límites suaves. Mol. Biol. Evolución. 23, 212–226 (2006).

Yang, Z. PAML 4: un paquete de programas para análisis filogenético por máxima verosimilitud. Mol. Biol. Evolución. 24, 1586-1591 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Demarchi, B. et al. Las secuencias de proteínas unidas a las superficies minerales persisten en el tiempo. eLife 5, e1709 (2016).

Ma, B. y col. PEAKS: potente software para secuenciación de novo de péptidos mediante espectrometría de masas en tándem. Comunicacion Rapida. Espectro de masas. 17, 2337–2342 (2003).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Miller, GH y cols. Colapso del ecosistema en la Australia del Pleistoceno y papel humano en la extinción de la megafauna. Ciencia 309, 287–290 (2005).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Phillips, DL y Gregg, JW Incertidumbre en la partición de fuentes utilizando isótopos estables. Ecología1 27, 171-179 (2001).

Artículo de Google Scholar

Legendre, LJ & Clarke, JA Los cambios en el grosor de la cáscara del huevo están relacionados con cambios en la ecología locomotora de los dinosaurios. Evolución 75, 1415-1430 (2021).

Artículo PubMed Google Scholar

Revell, LJ Phytools: un paquete R para biología filogenética comparada (y otras cosas). Métodos Ecología. Evolución. 3, 217–223 (2012).

Brown, JL y cols. Patrones de biodiversidad espacial de los anfibios y reptiles de Madagascar. MÁS UNO 11, e0144076 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Bonaparte, CL Clasificación ornitológica por series. Ana. Ciencia. Nat. 1, 139 (1853).

Google Académico

Milne-Edwards, A. & Grandidier, A. Observaciones sobre los Aepyornis de Madagascar. CR Semanal. Sesión Acad. Ciencia. París 13, 122-127 (1894).

Google Académico

Andrews, CW Sobre algunos restos de Aepyornis en el Excmo. Museo de Walter Rothschild en Tring. Novit. Zoológico. 2, 23-25 ​​(1895).

Google Académico

Burckhardt, R. Acerca de Aepyornis. Paleontol. Tratado 2, 127-145 (1893).

Google Académico

Monnier, L. Paleontología de Madagascar VII, Los Aepyornis. Ana. Paleontol. 8, 125-172 (1913).

Google Académico

Rowley, GD Sobre el huevo de Aepyornis, el ave colosal de Madagascar. Proc. Zoológico. Soc. Londres. 1867, 892–895 (1867).

Google Académico

Milne-Edwards, A. & Grandidier, A. Nuevas observaciones sobre los caracteres zoológicos y las afinidades naturales de los Aepyornis de Madagascar. J. Acad. Nat. Ciencia. 69, 83–87 (1869).

Google Académico

Descargar referencias

Este trabajo fue financiado por una subvención del Consejo Australiano de Investigación (ARC) otorgada a JH (DE120100107). MB recibió el apoyo de esta investigación mediante una futura beca ARC (FT0991741). GF desea reconocer a la Sociedad Nacional de Geografía, así como al Premio al Científico Distinguido Easterbrook (de la División de Geología Cuaternaria y Geomorfología de la Sociedad Geológica de América), por financiar viajes de recolección de muestras en Madagascar. El trabajo de BD recibió el apoyo del Ministerio de Universidad e Investigación (Jóvenes investigadores “Rita Levi Montalcini”). Las colecciones de KD fueron posibles gracias a la financiación del Programa de becas de investigación para graduados de la Fundación Nacional de Ciencias, el Premio Académico PEO, el Instituto de Estudios Biosféricos de Yale, el Centro MacMillan de Estudios Internacionales y de Área de Yale y el Consejo de Estudios Arqueológicos de Yale. Los permisos de investigación fueron otorgados por el Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique, Autorisation Numéro 128/13-MESupReS/SG/DGRP y por el Centre de Documentation et de Recherche sur l'Art et les Traditions Orales Malgaches (CEDRATOM). , bajo los auspicios del Memorando de Entendimiento entre la Universidad de Toliara, bajo la dirección del Dr. Barthélémy Manjakahery, Director del CEDRATOM, y la Universidad de Yale, bajo la dirección del Dr. Roderick McIntosh, Profesor de Antropología. El director Jean-Aimé Rakotoarisoa de L'Institut de Civilizations - Musée d'Art et d'Archéologie de l'Université d'Antananarivo (2006-2007) también concedió permisos de investigación a Gifford Miller (Universidad de Colorado, Boulder). Se utilizaron recursos informáticos del Pawsey Supercomputing Center (WA) para realizar búsquedas BLAST. Nos gustaría agradecer a Alison Devault de MYcroarry por su ayuda en el diseño de cebos de enriquecimiento. Damos un agradecimiento especial al equipo del Proyecto Arqueológico Morombe (MAP) y a la gente de Andavadoaka, Madagascar, por ayudar a recolectar cáscaras de huevo. Los autores agradecen las instalaciones y la asistencia científica y técnica del Centro Nacional de Imágenes del Centro de Microscopía, Caracterización y Análisis de la Universidad de Australia Occidental, un centro financiado por la Universidad, los gobiernos estatales y de la Commonwealth. MM y MC cuentan con el apoyo del Premio PROTEIOS de la Fundación Nacional Danesa de Investigación (DNRF128). Agradecemos al Prof. Jesper Velgaard Olsen del Centro Novo Nordisk para la Investigación de Proteínas por brindar acceso y recursos, que también fueron financiados en parte por una donación de la Fundación Novo Nordisk (Subvención No. NNF14CC0001). También nos gustaría reconocer el fallecimiento de la profesora Marilyn Fogel en 2022 y agradecerle sus contribuciones a la investigación de isótopos estables.

Laboratorio de trazas y ADN ambiental (TrEnD), Facultad de Ciencias Biológicas y Moleculares, Universidad de Curtin, Bentley, WA, 6102, Australia

Alicia Grealy y Michael Bunce

Herbario Nacional de Australia, CSIRO, Bldg 502 Clunies Ross Street, Acton, ACT, 2601, Australia

Alicia Greally

INSTAAR y el Departamento de Ciencias Geológicas, Universidad de Colorado, Boulder, CO, 80309, EE. UU.

Gifford H. Miller

Grupo de Evolución de Vertebrados, Facultad de Biología y Ciencias Ambientales, Universidad Tecnológica de Queensland, Brisbane, QLD 4000, Australia

Mateo J. Phillips

Integrity Ag & Environment, 10511 New England Highway, Highfields, QLD 4352, Australia

Simón J. Clarke

Instituto EDGE, Universidad de California Riverside, 900 University Ave, Riverside, CA, 92521, EE. UU.

marilyn fogel

Centro de Microscopía, Caracterización y Análisis, Instituto Harry Perkins de Investigación Médica, Universidad de Australia Occidental, Crawley, WA, 6009, Australia

Diana Patalwala, Paul Rigby y Alysia Hubbard

Centro Nacional de Imágenes, Universidad de Australia Occidental, Crawley, WA, 6009, Australia

Diana Patalwala

Departamento de Ciencias de la Vida y Biología de Sistemas, Universidad de Turín, Via Accademia Albertina, 13, 10123, Torino, Italia

Beatrice Demarchi y Jorune Sakalauskaite

The Globe Institute, Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud, Universidad de Copenhague, Oster Farimagsgade 5, Bygning 7.101, 1353, Copenhague, Dinamarca

Matthew Collins, Meaghan Mackie y Jorune Sakalauskaite

Instituto McDonald de Investigaciones Arqueológicas, Universidad de Cambridge, 2.4 West Tower, Downing St, Cambridge, CB2 3ER, Reino Unido

Mateo Collins

Centro de la Fundación Novo Nordisk para la Investigación de Proteínas, Departamento de Ciencias Biomédicas, Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud, Universidad de Copenhague, Blegdamsvej 3B, 6.2, 2200, Copenhague, Dinamarca

Meaghan Mackie

Centro Villum de Genómica de la Biodiversidad, Sección de Ecología y Evolución, Departamento de Biología, Universidad de Copenhague, 2100, Copenhague, Dinamarca

Josefina Stiller

Departamento de Ciencias Geológicas, Universidad de Texas en Austin, 2275 Speedway Stop C9000, Austin, TX, 78712, EE. UU.

Julia A. Clarke y Lucas J. Legendre

The Climate School, Universidad de Columbia, Nueva York, NY, 10025, EE. UU.

Kristina Douglass

Instituto de Zoología, Sociedad Zoológica de Londres, Regent's Park, Londres, NW1 4RY, Reino Unido

James Hansford

Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad del Norte de Illinois, DeKalb, IL, EE. UU.

James Hansford

Departamento de Ciencias de la Tierra, University College London, Gower Street, Londres, WC1E 6BT, Reino Unido

James Hansford

Laboratorio de Investigación de Arqueología e Historia del Arte, Universidad de Oxford, Oxford, OX12JD, Reino Unido

James Haile

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MB, GM y J.Haile concibieron el estudio. MB supervisó el estudio. AG y MB diseñaron los experimentos. AG realizó los experimentos genéticos. AG analizó los datos genéticos con la ayuda de MP; GM, KD y J.Hansford recolectaron y suministraron cáscaras de huevo para análisis genéticos. GM realizó la datación, la racemización de aminoácidos y los experimentos de isótopos con SC; AG analizó los datos de isótopos con la ayuda de GM, SC y MF; KD realizó citas. DP realizó los análisis micro-CT y 2D/3D. AG analizó los datos de micro-CT. PR y AH realizaron microscopía confocal. BD, MC, MM, J.Sakalauskaite y J.Stiller realizaron antiguos experimentos con proteínas y analizaron los datos. LJL realizó cálculos del tamaño corporal y reconstrucciones del estado ancestral con la ayuda de JC; AG escribió el manuscrito con aportaciones de los coautores. La publicación de este artículo fue financiada en parte por el Fondo de Acceso Abierto a Bibliotecas de Boulder de la Universidad de Colorado.

Correspondencia a Alicia Grealy o Gifford H. Miller.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Kieren Mitchell, Trevor Worthy y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Grealy, A., Miller, GH, Phillips, MJ et al. La exploración molecular de cáscaras de huevos fósiles descubre el linaje oculto de un ave gigante extinta. Nat Comuna 14, 914 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36405-3

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Recibido: 04 de agosto de 2022

Aceptado: 31 de enero de 2023

Publicado: 28 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36405-3

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