Etiqueta

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 12746 (2022) Citar este artículo

1099 Accesos

Detalles de métricas

La caracterización holográfica total (THC) se presenta aquí como un método eficiente, automatizado y sin etiquetas para identificar con precisión la viabilidad celular. El THC es una tecnología de caracterización de partículas individuales que determina el tamaño y el índice de refracción de partículas individuales utilizando la teoría de dispersión de la luz de Lorenz-Mie. Aunque la evaluación de la viabilidad celular es un desafío en muchas aplicaciones, incluida la fabricación de productos biológicos, los enfoques tradicionales a menudo incluyen un etiquetado poco confiable con tintes y/o métodos de recuento manual de células que requieren mucho tiempo. En este trabajo medimos la viabilidad de la levadura Saccharomyces cerevisiae en presencia de diversas concentraciones de isopropanol en función del tiempo. Todas las mediciones de THC se realizaron en el entorno nativo de la muestra sin dilución ni adición de etiquetas. Las mediciones holográficas se realizaron con un microscopio holográfico en línea utilizando una lente objetivo de 40\(\times\) con iluminación de onda plana. Comparamos nuestros resultados con THC con el recuento manual de células vivas y muertas distinguidas con tinte azul tripán. Nuestros hallazgos demuestran que el THC puede distinguir eficazmente las células de levadura vivas y muertas mediante el índice de refracción de las células individuales.

El uso de células de levadura, particularmente Saccharomyces cerevisiae, es omnipresente tanto en la industria como en el mundo académico1,2,3 para aplicaciones que van desde experimentos celulares hasta la fabricación de proteínas. Por ejemplo, en la investigación médica la levadura sirve como organismo modelo para estudiar mutaciones genéticas relevantes en el cáncer4,5,6. En la investigación y fabricación biofarmacéutica, las células de levadura se emplean como minifábricas para la producción de proteínas de interés7,8,9. Además, en una de las aplicaciones más conocidas, la levadura se utiliza en la investigación y fabricación de productos de consumo para optimizar la elaboración de cerveza, vino y pan10,11,12,13.

La viabilidad celular es un parámetro clave de interés en muchas de estas aplicaciones14. Si bien existen numerosos métodos para medir la viabilidad de la levadura, la mayoría comparte una limitación: la necesidad de teñir las células con un tinte. Los métodos basados ​​en tintes, como el ensayo de exclusión de azul tripán (TB), se basan en que las membranas celulares sanas sean impermeables al tinte, mientras que las membranas de las células muertas o dañadas permiten que el tinte se difunda dentro de la célula15. Aunque este método es útil, normalmente implica una tediosa preparación de muestras y un recuento celular manual. El recuento celular manual adolece de estadísticas bajas y es propenso a errores humanos. Además, se ha demostrado que el ensayo de exclusión de tuberculosis sobreestima la viabilidad y no es confiable para ciertas muestras de células con una viabilidad inferior al 70%-80%16,17,18.

Además, con cualquier medición de viabilidad de tinción basada en tintes, existe el peligro de que el tinte pueda interactuar con las células o con otra variable experimental de forma no deseada. Por ejemplo, se ha demostrado que el azul tripán interactúa negativamente con las células, a menudo rompiéndolas y, por lo tanto, haciendo que las mediciones de viabilidad no sean confiables19. Aunque las deficiencias de los ensayos de viabilidad basados ​​en etiquetas son bien conocidas, existen pocas alternativas sin etiquetas20.

En este trabajo presentamos una técnica automatizada y sin etiquetas para medir de manera confiable la viabilidad de la levadura utilizando Total Holographic Characterization® (THC). El THC es una tecnología, basada en videomicroscopía holográfica, desarrollada para detectar, contar y caracterizar partículas subvisibles en suspensión21. Aquí evaluamos la viabilidad de la levadura utilizando xSight, que implementa THC y combina microscopía holográfica con manejo de muestras de microfluidos para proporcionar mediciones precisas del tamaño de las partículas y el índice de refracción. El uso de chips de muestras de microfluidos de un solo uso garantiza que no haya contaminación cruzada entre muestras y que no sea necesaria limpieza. Cada medición está automatizada y tarda aproximadamente 15 minutos en completarse.

Las imágenes holográficas se han utilizado con células vivas en estudios anteriores22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35. Varios estudios midieron y rastrearon importantes parámetros biofísicos celulares, como el volumen celular, el espesor celular y la masa seca22,23,28,31,32. Sin embargo, la limitación de estos enfoques es la necesidad de intercambios de medios y manipulación de la osmolaridad de los medios para estimular cambios en el volumen celular y el índice de refracción. El presente trabajo realiza mediciones en el entorno nativo de las células sin necesidad de cambios o modificaciones de medios. También se han logrado avances significativos en la medición del índice de refracción de células de mamíferos individuales utilizando imágenes de fase cuantitativa con microscopía holográfica digital31,32. En estos estudios, el índice de refracción se correlacionó con el tamaño de las células y se utilizó para distinguir dos líneas celulares de cáncer de páncreas humano. Sin embargo, en los estudios que midieron el índice de refracción de células completas, no se informó ninguna correlación con la viabilidad celular. Quienes han evaluado la salud celular mediante técnicas holográficas lo han hecho en células de mamíferos en condiciones específicas, como infecciones por P. falciparum29, exposición al cadmio30, exposición a una variedad de nanopartículas orgánicas33 y otros compuestos tóxicos34,35. En este trabajo medimos el índice de refracción de células enteras de levadura en un medio único en su entorno nativo. Mostramos que el índice de refracción de las células se puede determinar rápidamente con THC y utilizar para evaluar con precisión la viabilidad con esta novedosa técnica automatizada sin etiquetas.

Para demostrar que el THC es una nueva tecnología para los estudios de viabilidad, utilizamos alcohol para matar gradualmente las células de levadura, como se hizo en estudios previos de viabilidad de la levadura36,37. Mostramos los cambios de viabilidad de Saccharomyces cerevisiae bajo diversas concentraciones de isopropanol y comparamos nuestros resultados con la tinción con azul tripán.

Empleamos microscopía de video holográfica21,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47 para evaluar la viabilidad de la levadura. En nuestro enfoque, las partículas en suspensión (como las células de levadura) fluyen a través de un chip de microfluidos mientras son iluminadas por un rayo láser colimado. La luz láser dispersada por las partículas interfiere con la luz láser incidente, formando un patrón de interferencia llamado holograma. En la figura 1a se muestra un esquema de esta tecnología.

(a) Un esquema de microscopía de video holográfica: a medida que las células fluyen a través de un chip de microfluidos, son iluminadas por un rayo láser. La luz dispersada por las partículas interfiere con la luz incidente, formando hologramas que se graban en una cámara. (b) Un diagrama de dispersión del tamaño en el eje horizontal y el índice de refracción en el eje vertical para 4 especies de partículas: esferas de poliestireno de \(1,51\,\upmu\)m de diámetro (en cian), \(2,56\,\upmu\) Esferas de poliestireno de )m de diámetro (en violeta), esferas de sílice de \(1,49\,\upmu\)m de diámetro (en naranja), esferas de sílice de \(2,63\,\upmu\)m de diámetro (en amarillo). Cada punto del gráfico representa una sola partícula detectada con THC durante la medición. Los cuadros coloreados son regiones de interés definidas por el usuario. Las partículas fuera de los 4 cuadros definidos por el usuario son de color gris.

Los hologramas se graban en una cámara y se ajustan a la teoría de la dispersión de la luz de Lorenz-Mie40,48,49,50. Una optimización rápida y multiparamétrica del ajuste produce varios parámetros de partículas, incluido el tamaño de las partículas, el índice de refracción y la posición tridimensional que corresponden a ese holograma. No reconstruimos la imagen tridimensional de cada partícula, sino que extraemos información morfológica sobre cada partícula a partir de la simetría de su holograma bidimensional. Una ventaja clave de este enfoque, basado en videomicroscopía holográfica, es que, además del tamaño de las partículas, el THC cuantifica el índice de refracción de cada partícula, que es indicativo de su composición. Por ejemplo, la Fig. 1b muestra un diagrama de dispersión de una muestra que consta de una mezcla de cuatro especies de partículas diferentes: dos tamaños de microesferas de poliestireno y dos tamaños de microesferas de sílice. Cada punto del gráfico representa una única partícula detectada por xSight durante la medición. En el eje horizontal está el diámetro de partícula medido y en el eje vertical está el índice de refracción de partícula medido. Los cuadros coloreados son regiones de interés definidas por el usuario que corresponden a diferentes especies de partículas. Los puntos se colorean según la región a la que pertenecen. En el diagrama de dispersión, se pueden observar fácilmente cuatro distribuciones de partículas principales: dos con un índice de refracción de aproximadamente 1,61 en cian y violeta y dos con un índice de refracción de aproximadamente 1,43 en naranja y amarillo. Esos pares de distribuciones son microesferas de poliestireno y sílice, respectivamente. El índice de refracción del poliestireno en agua cuando se ilumina con un láser azul es 1,61 y un índice de refracción de 1,43 es consistente con la sílice porosa. Es importante señalar que con un medidor de partículas estándar, solo dos poblaciones serían visibles en esta muestra: una con un diámetro de partícula de alrededor de \(1,5\,\upmu\)m y otra con un diámetro de partícula de alrededor de \(2,6). \,\upmu\)m. Dado que el THC mide el índice de refracción además del tamaño, se pueden distinguir fácilmente partículas del mismo tamaño pero de composición diferente, como las esferas de sílice de \(1,49\,\upmu\)m y de poliestireno de \(1,51\,\upmu\)m (en naranja y cian respectivamente) y las esferas de sílice \(2.63\,\upmu\)m y de poliestireno \(2.56\,\upmu\)m (en amarillo y violeta respectivamente).

Esta tecnología se ha utilizado de manera similar para distinguir bacterias de perlas de plástico y aceite en agua51, ya que cada una de esas especies está compuesta de materiales con diferentes índices de refracción. Un estudio de partículas porosas de sílice demostró que el THC es capaz de detectar cambios sutiles en la composición de las partículas52,53. La capacidad de detectar pequeños cambios en la composición de las partículas se debe al modelo de esfera efectiva y a la teoría del medio efectivo52,54. El THC caracteriza cada partícula que fluye a través de la región de visualización del chip de microfluidos y la analiza asumiendo que es una esfera. El THC encuentra una esfera efectiva con un holograma muy similar al holograma de la partícula que se analiza. Cuando la composición de una partícula individual es heterogénea, de modo que varios componentes de una partícula tienen diferentes índices de refracción, el algoritmo de ajuste de THC producirá un índice de refracción para esa partícula que es un promedio de los índices de refracción de sus diversos componentes. En el ejemplo de una partícula porosa de sílice en agua, el índice de refracción de una partícula determinada estará entre el índice de refracción de la matriz de sílice y el índice de refracción del agua que llena sus poros. Hasta qué punto el índice de refracción efectivo resultante estará más cerca del sílice o más cerca del agua depende de la porosidad de la partícula. Por tanto, es posible extraer información morfológica del comportamiento del índice de refracción de las partículas en medios de índices de refracción variables. Se ha estudiado información morfológica cuantitativa sobre la porosidad de las partículas en plásticos porosos, agregados de proteínas y aglomerados de nanopartículas52,55. Además, se han fotografiado y modelado diversas formas de partículas con THC, incluidos fractales coloidales56, esferas porosas52,53, E. coli en forma de bastón51, dímeros de microesferas57 y discos transparentes58. En nuestro enfoque, mientras que la dispersión de cada partícula se ajusta a un modelo de esfera, las partículas no esféricas de diversas formas son adecuadas para el análisis con THC.

Las células de levadura también son partículas heterogéneas con varios componentes celulares que actúan como materiales de dispersión con diferentes índices de refracción. Dado que la muerte celular a menudo implica cambios fisiológicos en la estructura y composición celular, se espera que estos cambios alteren el índice de refracción y la forma de las células y, por lo tanto, deben detectarse mediante análisis con THC.

En la Fig. 2a se muestra un diagrama de dispersión típico de THC de una muestra de levadura antes de la introducción del alcohol. Los cuadros naranja y cian son regiones definidas por el usuario que corresponden a células de levadura vivas y muertas, respectivamente. Los puntos se colorean según la región a la que pertenecen. Los puntos naranjas corresponden a partículas identificadas como células muertas, los puntos cian corresponden a partículas identificadas como células vivas y los grises son otras partículas identificadas como desechos (ver Discusión a continuación). En la muestra, que se muestra en la Fig. 2a, el 51,4% de todas las partículas detectadas se identifican como células vivas, el 29,7% se identifican como células muertas y el 18,9% como desechos.

(a) Un diagrama de dispersión del tamaño en el eje horizontal y el índice de refracción en el eje vertical para una muestra de levadura antes de la adición de alcohol. Cada punto del gráfico representa una única partícula que fluyó a través de la región de visualización del chip de microfluidos durante el análisis de THC. Los cuadros coloreados son regiones de interés definidas por el usuario. Los puntos coloreados en naranja representan células de levadura muertas y los puntos coloreados en cian representan células de levadura vivas. Las partículas fuera de los cuadros definidos por el usuario aparecen en color gris. (b) Distribuciones de densidad del tamaño de partícula para la muestra que se muestra en (a). Las curvas naranja, cian y gris representan las distribuciones de densidad de tamaño de células muertas, células vivas y todas las partículas, respectivamente. El área bajo cada curva para un rango de tamaño determinado representa el número de partículas (de las especies representadas por esa curva) en ese rango de tamaño. El pico de cada curva muestra el tamaño más común de cada tipo de partícula. (c) Distribuciones de densidad del índice de refracción de partículas para la muestra que se muestra en (a). La coloración es la misma que en (b). El área bajo cada curva para un rango de índice de refracción determinado representa el número de partículas (de las especies representadas por esa curva) en ese rango de índice de refracción. El pico de cada curva muestra el índice de refracción más común de cada tipo de partícula. (d)–(f) Gráfico de dispersión, gráfico de densidad de tamaño y gráfico de densidad del índice de refracción como en (a)–(c), pero para una muestra de levadura que estuvo expuesta a 15% de isopropanol por volumen durante 71 minutos.

Como se puede ver en la Fig. 2a, si bien las células vivas y muertas se superponen en tamaño, sus índices de refracción son distintos. En esta muestra se encontraron células vivas en el rango de tamaño de \(3,5\,\upmu\)m a \(6,2\,\upmu\)m e índices de refracción entre 1,39 y 1,416. Las células muertas aparecieron en tamaños ligeramente más pequeños: 2,5–5,2\(\upmu\)m e índices de refracción significativamente mayores: entre 1,417 y 1,462. La superposición en tamaño y la distinción en el índice de refracción de células vivas y muertas se ilustra con más detalle en la Fig. 2b, c. Estos gráficos son distribuciones de densidad de índice de refracción y tamaño, respectivamente. La curva de densidad de tamaño en la Fig. 2b, por ejemplo, está relacionada con la probabilidad de que una partícula tenga un tamaño particular. El área bajo la curva sobre cualquier rango de tamaño de partícula representa la cantidad de partículas que se pueden encontrar en ese rango de tamaño. Estas curvas son alternativas más informativas y confiables que los histogramas. En estos gráficos, las curvas grises representan todas las partículas, las curvas naranjas representan células muertas y las curvas cian representan células vivas. En la Fig. 2b, la superposición de las curvas naranja y cian indica que muchas células vivas y muertas tienen el mismo tamaño. La superposición de las distribuciones de tamaño muestra que identificar la viabilidad únicamente por el tamaño de la celda no es confiable. Según la Fig. 2c, la curva de densidad del índice de refracción naranja y la curva de densidad del índice de refracción cian muestran una superposición mínima, lo que sugiere que las células de levadura vivas y muertas se distinguen por el índice de refracción. En la Fig. 2c, el pico de la curva cian está cerca de 1,4, lo que indica que el índice de refracción más común de las células vivas es de alrededor de 1,4, mientras que el pico de la curva naranja está cerca de 1,435, lo que indica que el índice de refracción más común de las células muertas es de alrededor de 1,435.

Las Figuras 2d a f muestran los resultados de la misma muestra de levadura pero 71 minutos después de la adición de isopropanol al 15% en volumen. Como se ve en la Fig. 2d, la mayoría de los puntos son de color naranja, lo que indica que la mayoría de las células han muerto con esta exposición al alcohol. En esta muestra, sólo el 2,9% de todas las partículas detectadas se identifican como células vivas, el 82,4% como células muertas y el 14,7% como restos. Este resultado está representado por la Fig. 2e, f donde las curvas grises y las curvas naranjas se superponen, lo que sugiere que la mayoría de las partículas identificadas corresponden a células muertas. Si bien la curva cian está presente y es dominante en la Fig. 2c, falta casi por completo en la Fig. 2f, lo que confirma la escasez de células vivas en una solución de isopropanol al 15% después de 71 minutos.

Para explorar cómo responde la levadura a diferentes concentraciones de isopropanol a lo largo del tiempo y comparar nuestro enfoque holográfico con el ensayo de exclusión de tuberculosis, expusimos muestras de levadura a 0%, 15% y 20% de isoproponal por volumen y medimos la viabilidad resultante a lo largo del tiempo usando ambos. xSight y azul tripán. La Figura 3 muestra los resultados de estos estudios.

El eje horizontal representa el tiempo después de la adición de alcohol. El eje vertical representó el porcentaje de células vivas normalizadas en el momento inicial antes de que se agregara alcohol. Todas las curvas continuas son mediciones con THC y todas las curvas discontinuas son mediciones de tinción con azul tripán. Las curvas azules representan los resultados de las muestras de control sin alcohol. Las curvas amarillas representan resultados de muestras con 15% de isopropanol por volumen. Las curvas naranjas representan los resultados de las muestras con 20% de isopropanol en volumen.

En el gráfico de la Fig. 3, el eje horizontal es el tiempo después de que se agregó alcohol a la mezcla de levadura y el eje vertical es el porcentaje de células vivas normalizado por el porcentaje vivo antes de agregar el alcohol. En la Fig. 3, las curvas continuas representan mediciones con THC y las curvas discontinuas son mediciones realizadas con el ensayo de exclusión de tuberculosis. Las curvas azules corresponden a la viabilidad normalizada de muestras de levadura sin alcohol. Si bien se observa cierta fluctuación en esas curvas, todas las curvas son similares entre sí y no muestran pérdida de viabilidad en el transcurso de 80 minutos. Las curvas amarillas representan resultados para muestras a las que se les agregó un 15 % de alcohol por volumen. En todas las curvas amarillas se observa una disminución similar en la viabilidad normalizada a lo largo del tiempo. Las curvas naranjas representan resultados para muestras a las que se les agregó un 20 % de alcohol por volumen y muestran una caída más rápida de la viabilidad en función del tiempo. En todas las condiciones, las curvas discontinuas son similares a las curvas continuas, lo que sugiere una fuerte concordancia en los cambios de viabilidad normalizados entre el THC y el ensayo de exclusión de tuberculosis.

Tenga en cuenta que, si bien los resultados de viabilidad normalizados son consistentes entre los resultados de THC y los resultados de la tinción de TB, las viabilidades absolutas pueden variar. De hecho, encontramos una sobreestimación constante de la viabilidad absoluta utilizando TB en comparación con los resultados holográficos. Seis mediciones consecutivas de una muestra de levadura con THC arrojaron una viabilidad promedio de \(52,3 \pm 0,9 \%\). La misma muestra medida con tinción TB dio como resultado una viabilidad promedio de \(56 \pm 3 \%\). Además de una medición de viabilidad más alta, consistente con un recuento insuficiente de células muertas, la tinción de TB también mostró una mayor variabilidad entre mediciones. Esta observación es consistente con otros estudios que informaron tales limitaciones en el enfoque de tinción de TB16.

La tinción de Saccharomyces cerevisiae con tuberculosis mostró una población mixta de células vivas y muertas antes del tratamiento con alcohol. Como se muestra en la Fig. 4a, en una sola cuadrícula, se ve una combinación de células vivas (sin teñir y etiquetadas en azul), así como células muertas (teñidas y etiquetadas en naranja). Si bien la categorización de viabilidad es clara en la Fig. 4a, es menos clara en la Fig. 4b, particularmente en los casos encerrados en un círculo gris. Las células que absorben parcialmente el tinte y las que se agrupan plantean un desafío para los ensayos de viabilidad basados ​​en tinción.

Resultados típicos de un ensayo de exclusión de azul tripán. (a) Una celda de cuadrícula que muestra una mezcla de células de levadura vivas y muertas. Las células vivas no absorben el tinte y aparecen de color gris claro. Están identificados con flechas azules. Las células muertas son permeables al tinte y aparecen de color azul oscuro/gris. Se identifican con flechas naranjas (b) Una celda de cuadrícula que muestra células con un estado de viabilidad no concluyente según el ensayo de exclusión de azul tripán. Aquellos cuyo estatus no es concluyente están circunscritos por círculos grises.

La presencia de células teñidas de forma ambigua, como en la Fig. 4b, también puede contribuir a la mayor variabilidad mencionada anteriormente en las mediciones de tinción que en las mediciones con THC.

Además de medir el tamaño de las partículas y el índice de refracción, el THC también analiza la morfología de las partículas. Más específicamente, la simetría del holograma correspondiente a una partícula determinada es indicativa de la simetría de la propia partícula. Se espera que una partícula perfectamente esférica tenga un holograma casi perfectamente simétrico, mientras que las partículas que se desvían de las esferas muestran desviaciones de la simetría en sus hologramas. Estas desviaciones de la simetría esperada, \(\Delta S\), se analizan y cuantifican con THC. La Figura 5a a continuación muestra un esquema de tres formas de partículas con una desviación creciente de la simetría, \(\Delta S\). En la Fig. 5b, la primera columna muestra ejemplos de hologramas de una esfera de poliestireno de 1,54 \(\upmu\)m, una célula de levadura muerta y una célula de levadura viva. La segunda columna de la Fig. 5b muestra los ajustes de cada uno de esos hologramas a la teoría de la dispersión de la luz de Lorenz-Mie. La tercera columna muestra los residuos entre los hologramas y sus respectivos ajustes. La métrica \(\Delta S\) a su vez se calcula en función de los residuos de los ajustes. Los residuos más altos corresponden a una mayor desviación de la simetría y contribuyen a valores de \(\Delta S\) más altos.

(a) Esquema de partículas con una desviación creciente de la simetría de arriba a abajo. El círculo de puntos naranja representa la esfera estimada que más se aproxima a la partícula dada. (b) Hologramas, ajustes a la teoría de Lorenz-Mie y residuos (de izquierda a derecha, respectivamente) de una esfera de poliestireno, una célula de levadura muerta y una célula de levadura viva (de arriba a abajo, respectivamente). (c) Distribuciones de densidad de probabilidad de la desviación de la simetría, \(\Delta S\), de \(1.54\,\upmu\)m esferas de poliestireno (en amarillo), células de levadura muertas (en naranja) y células de levadura vivas ( en cian). (d) Un histograma de diferencias entre las medias de \(\Delta S\) de células de levadura vivas y muertas para 45 mediciones de muestra.

El análisis morfológico de células de levadura vivas y muertas con THC muestra que las células muertas son más esféricas que las vivas. La Figura 5c muestra tres distribuciones de densidad de probabilidad de \(\Delta S\): la de las microesferas de poliestireno en amarillo, la de las células de levadura muertas en naranja y la de las células de levadura vivas en cian. Las desviaciones de simetría de las microesferas de poliestireno son las más cercanas a \(\Delta S = 0\), lo que indica un alto grado de simetría esférica como se esperaba. La curva naranja, correspondiente a las células de levadura muertas, contiene 2295 células y está más alejada de \(\Delta S = 0\), mientras que la curva cian, correspondiente a las células vivas, contiene 1916 células y está más alejada de \(\Delta S = 0\). Las medias \(\Delta S\) son significativamente diferentes (\(\hbox {p}<0.0001\)) entre las poblaciones de células vivas y muertas. El resultado de que \(\Delta S\) es más pequeño para las células muertas que para las células vivas indica que las células de levadura muertas son más esféricamente simétricas que las células vivas. La Figura 5d muestra un histograma de diferencias entre la media \(\Delta S\) para células vivas, \(\overline{\Delta S}_{live}\), y la media \(\Delta S\) para células muertas , \(\overline{\Delta S}_{muerto}\). El histograma contiene datos de 45 muestras de levadura expuestas a diversas concentraciones de alcohol. Dado que \(\overline{\Delta S}_{live} - \overline{\Delta S}_{dead} > 0\) para cada muestra, las células de levadura muertas parecían más esféricas que las células vivas en cada medición. Si bien este hallazgo en levaduras no se había informado anteriormente, tales cambios morfológicos se han identificado en células cancerosas expuestas a cambios de pH que conducen a su muerte celular59 y la forma esférica se ha correlacionado con la muerte celular en E. coli60.

Nuestros resultados indican que la viabilidad de las células de levadura se puede evaluar eficazmente utilizando THC. En promedio, las células de levadura redujeron su tamaño y aumentaron su índice de refracción tras la exposición a altas concentraciones de alcohol y ante la eventual muerte celular. Si bien observamos una disminución promedio en el tamaño de las células muertas en comparación con las vivas, el tamaño por sí solo es insuficiente para distinguir las poblaciones vivas y muertas. Nuestros resultados demuestran que el índice de refracción celular es un identificador distintivo más eficaz de la viabilidad celular. Esta conclusión también es consistente con los cambios morfológicos de las células. Si las células se encogen debido a la expulsión de agua de bajo índice de refracción y los subcomponentes celulares restantes tienen un índice de refracción más alto que el agua, entonces el índice neto de refracción de la célula aumentará como se observa en nuestras mediciones. El THC caracteriza cada partícula que fluye a través del chip de microfluidos xSight y la analiza como una esfera. La optimización multiparamétrica encuentra una esfera efectiva con un holograma más similar al holograma de la partícula que se analiza52,54. Una célula más pequeña con componentes de dispersión más fuertes se identificará como una partícula más pequeña con un índice de refracción aumentado. Este escenario es consistente con nuestros resultados. En otros estudios se han informado cambios similares en las propiedades ópticas de las células en respuesta al estrés externo, como la presión osmótica22,31.

Además de evaluar la viabilidad, nuestro enfoque holográfico también es una forma prometedora de estudiar la progresión hacia la muerte celular u otras respuestas al estrés. Dado que muchos cambios morfológicos pueden manifestarse como cambios en el tamaño de las células y el índice de refracción, el THC puede ser una herramienta poderosa para rastrear cuantitativamente esos cambios en tiempo real. Por ejemplo, varios estudios han explorado el uso de la holografía para determinar la toxicidad de diversos compuestos mediante la observación de cambios biofísicos en células de mamíferos29,30,33,34,35. Nuestro enfoque, que utiliza THC, es una interesante herramienta complementaria a las tecnologías existentes. Puede ofrecer una evaluación rápida de los cambios en el tamaño y el índice de refracción de las células vivas en su entorno nativo en respuesta a las toxinas de interés.

Además de identificar células vivas y muertas, nuestra tecnología identificó una tercera población de partículas etiquetadas en gris en la Fig. 2a, d). Esas partículas eran en gran medida más pequeñas o de menor índice que lo que identificamos como células de levadura. Es posible que se trate de fragmentos de células. También podrían ser agregados de materiales producidos por la levadura en solución o contaminantes de otras fuentes. La combinación de tamaño e índice de refracción de muchas de estas partículas es consistente con lo que se ha observado para los agregados de proteínas con THC55,61,62. Se necesita más investigación para identificar de manera concluyente esas partículas.

En este trabajo hemos explorado la respuesta de Saccharomyces cerevisiae a diversas concentraciones de isporpopanol. Otros estudios han investigado la viabilidad celular en respuesta a estreses como otros alcoholes, presión osmótica y calor36,37,63,64. El THC también es un enfoque prometedor para estudiar la viabilidad en esas condiciones. Ofrece un enfoque complementario a otras tecnologías en desarrollo que utilizan otras técnicas de dispersión. Los cambios holográficos en las células tras la muerte deberían observarse de manera similar en otros tipos de células, como bacterias y células animales. El THC debería ser una herramienta útil para estudiar una amplia gama de sistemas biológicos.

Nuestros resultados presentan un enfoque poderoso para evaluar la viabilidad de la levadura mediante microscopía de video holográfica. La muerte celular en respuesta a la exposición al alcohol coincidió con un aumento poblacional en el índice de refracción celular, lo que sugiere que este parámetro óptico es eficaz para identificar células vivas y muertas. El enfoque holográfico propuesto es rápido, automatizado y sin etiquetas, lo que elimina muchas de las limitaciones de los ensayos de viabilidad tradicionales basados ​​en tinciones. La metodología es objetiva y no requiere la identificación del usuario de cada celda una vez que se identifican las regiones del índice de refracción. Por lo tanto, el THC se puede ampliar al análisis de viabilidad automatizado de alto rendimiento en una variedad de aplicaciones industriales.

La solución de levadura se preparó usando glucosa (marca SIGMA, artículo G8270-1KG), agua desionizada (DI) filtrada y levadura instantánea seca (marca de la tienda Amish Market, Nueva York, NY). Se preparó una mezcla madre de glucosa mezclando 25 g de agua desionizada con 0,5 g de glucosa hasta que la glucosa se disolvió por completo. Una vez disuelta, la mezcla de glucosa se filtró con un filtro de jeringa desechable luer lock de 60 cc (0,45 ,upmu) m (marca Millex). Si no se preparó para uso inmediato, la mezcla de glucosa se almacenó en un refrigerador \(4\,^{\circ }\)C.

La solución de glucosa se diluyó con agua desionizada filtrada en una proporción 1:1, utilizando 4 ml de cada una, en un vial de 30 ml. Usando levadura instantánea seca, se colocaron de 4 a 7 gránulos en la mezcla de glucosa diluida y el vial se agitó con la mano y se agitó hasta que se disolvieron todos los gránulos de levadura. Las soluciones de levadura se incubaron (Benchmark, Roto-Therm mini) a \(40\,^{\circ }\)C. Una vez que la incubadora estuvo a temperatura, la mezcla de levadura se colocó en la incubadora durante 30 min. Después de 30 minutos, la mezcla se retiró de la incubadora y se agitó brevemente para disolver la levadura restante. Se preparó una mezcla de levadura fresca para cada día de experimentos.

Se probaron tres concentraciones de alcohol: 0% de isopropanol (control), 15% de isopropanol por volumen en solución de glucosa y 20% de isopropanol por volumen en solución de glucosa. Cada concentración de alcohol se preparó colocando la solución en un vial de 10 ml y llevando el volumen final a un total de 2 ml. Para el control y para la solución de isopropanol al 15%, las muestras se midieron durante aproximadamente 90 minutos. Para la solución de isopropanol al 20%, las muestras se midieron durante aproximadamente 45 minutos. Para el control, se puso en marcha el cronómetro después de agitar la solución. Para las soluciones de alcohol al 15% y 20%, el cronómetro se puso en marcha (\(t=0\)) una vez que se colocó el alcohol en el vial de 10 ml con la solución de levadura. Para cada condición, se midió la viabilidad una vez antes de introducir el alcohol y luego consecutivamente después de la adición de alcohol.

Las mediciones de microscopía de video holográfica21,40,62 se realizaron utilizando xSight (Spheryx, Inc.), la implementación de THC de Spheryx. Para cada medición, se colocó un volumen de muestra de \(30\,\upmu\)L en uno de los ocho depósitos de un xCell, un chip de muestra de microfluidos desechable (Spheryx, Inc.). El flujo de la muestra a través del canal de microfluidos se estableció automáticamente en xSight mediante la aplicación de un sello de vacío y una bomba, creando un flujo Poiseuille uniforme21,57. Un rayo láser colimado con una longitud de onda de vacío de 638 nm iluminó la región de visualización del xCell mientras la muestra fluía. La luz dispersada por las partículas de la muestra interfirió con la luz incidente creando hologramas que se grabaron en una cámara para su posterior análisis. Cada holograma se analizó con THC, lo que dio como resultado un ajuste multiparamétrico para el tamaño, el índice de refracción y la posición tridimensional de cada partícula.

Para cada muestra, se midieron la viscosidad de la muestra y el índice de refracción del medio (agua con glucosa) y se ingresaron en xSight. El índice de refracción del medio se midió con un refractómetro de mano (Antago, refractómetro de bolsillo). Al presionar el botón INICIO se inició la medición. La medición se realiza automáticamente y dura aproximadamente 15 minutos para cada muestra.

La primera medición de la solución de levadura, antes de la adición de alcohol, se denominó punto temporal "\(t=-1\)" y se utilizó para normalizar el resto de la curva de viabilidad. Todos los demás puntos de tiempo se registraron como cuando se presionó el botón INICIO. El volumen medido para cada muestra fue \(1\,\upmu\)L.

Los cuadros que circunscribían las poblaciones de levaduras vivas y muertas eran regiones de interés definidas por el usuario habilitadas por el software xSight. Una vez definidas las regiones de interés, los resultados de los análisis de células vivas y muertas se calcularon automáticamente produciendo la concentración, el tamaño medio y el índice de refracción medio de cada población. Las regiones se determinaron para delimitar las distintas poblaciones. Luego se registró la viabilidad de cada muestra en función de las estadísticas calculadas automáticamente de cada región.

Las mediciones de tinción se prepararon en tubos de microcentrífuga (uLab Scientific). Se mezclaron \(30\,\upmu\)L de muestra de levadura y \(30\,\upmu\)L del tinte en el tubo y se dejaron reposar durante 2 minutos. Después de 2 minutos, se colocaron \(30\,\upmu\) L de la muestra teñida en un hemocitómetro Neubauer mejorado (Fristaden Labs). Se colocó un cubreobjetos encima del hemocitómetro y se observó bajo un microscopio (AmScope) con un aumento de 10x. En el hemocitómetro, se contaron las células en ocho cajas de cuadrícula de 4x4 para el análisis de viabilidad de la tinción. Una vez completado el recuento, se limpió el hemocitómetro con isopropanol y agua desionizada y se secó con un Kimwipe. Se dejó que el hemocitómetro se secara completamente al aire antes de realizar la siguiente medición. Al igual que con el THC, el momento de la primera medición, antes de que se introdujera el alcohol, estaba etiquetado como "\(t=-1\)". El inicio del experimento de tinción (\(t=0\)) se marcó cuando se introdujo el tinte en la muestra.

Parapouli, M., Vasileiadis, A., Afendra, A.-S. & Hatziloukas, E. Saccharomyces cerevisiae y sus aplicaciones industriales. OBJETIVOS Microbiol. 6, 1–32. https://doi.org/10.3934/microbiol.2020001 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Botstein, D. y Fink, GR Levadura: un organismo experimental para la biología del siglo XXI. Genética 189, 695–704. https://doi.org/10.1534/genetics.111.130765 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Duina, AA, Keeney, JB y Miller, ME Levadura en ciernes para genetistas en ciernes: una introducción al sistema modelo de Saccharomyces cerevisiae. Genética 197, 33–48. https://doi.org/10.1534/genetics.114.163188 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Guaragnella, N. et al. El papel cada vez mayor de la levadura en la investigación y el diagnóstico del cáncer: conocimientos sobre la función de los oncosupresores p53 y brca1/2. FEMS Levadura Res. 14, 2-16. https://doi.org/10.1111/1567-1364.12094 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Por favor, L. Levadura de LH Hartwell: un organismo modelo para estudiar mutaciones somáticas y cáncer. Nat. Educativo. 1, 183 (2008).

Google Académico

Ferreira, R., Limeta, A. & Nielsen, J. Abordar el cáncer con tecnologías basadas en levaduras. Tendencias Biotecnología. 37, 66. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.11.013 (2018).

Artículo CAS Google Scholar

Gomes, A., Carmo, T., Carvalho, L., Bahia, F. y Skorupa Parachin, N. Comparación de levaduras como huéspedes para la producción de proteínas recombinantes. Microorganismos 6, 38. https://doi.org/10.3390/microorganisms6020038 (2018).

Artículo CAS Google Scholar

Huang, M., Bao, J., Hallstrom, BM, Petranovic, D. y Nielsen, J. La producción eficiente de proteínas por parte de la levadura requiere un ajuste global del metabolismo. Nat. Comunitario.https://doi.org/10.1038/s41467-017-00999-2 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Hyunah, K., Yoo, S. & Kang, HA Biología sintética de levadura para la producción de proteínas terapéuticas recombinantes. FEMS Levadura Res. 15, 66. https://doi.org/10.1111/1567-1364.12195 (2014).

Artículo CAS Google Scholar

Lodolo, EJ, Kock, JL, Axcell, BC y Brooks, M. La levadura saccharomyces cerevisiae, el personaje principal en la elaboración de cerveza. FEMS Levadura Res. 8, 1018-1036. https://doi.org/10.1111/j.1567-1364.2008.00433.x (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Briggs, DE, Boulton, CA, Brookes, PA y Stevens, R. Elaboración de cerveza: ciencia y práctica (Woodhead Publishing, 2004).

Maicas, S. El papel de las levaduras en los procesos de fermentación. Microorganismos 8, 1142. https://doi.org/10.3390/microorganisms8081142 (2020).

Artículo CAS PubMed Central Google Scholar

Fleet, G. Levaduras en alimentos y bebidas: Impacto en la calidad y seguridad del producto. actual. Opinión. Biotecnología. 18, 170–5. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2007.01.010 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kwolek-Mirek, M. & Zadrag-Tecza, R. Comparación de métodos utilizados para evaluar la viabilidad y vitalidad de las células de levadura. FEMS Levadura Res. 14, 1068-1079. https://doi.org/10.1111/1567-1364.12202 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Strober, W. Prueba de exclusión de viabilidad celular con azul tripán. actual. Protocolo. Inmunol.https://doi.org/10.1002/0471142735.ima03bs111 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Chan, LL, Kuksin, D., Laverty, DJ, Saldi, S. y Jean, Q. Observación y análisis morfológicos mediante citometría de imagen automatizada para la comparación del método de detección de viabilidad basado en azul tripán y fluorescencia. Citotecnología 67, 461–473. https://doi.org/10.1007/s10616-014-9704-5 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mascotti, K., McCullough, J. & Burger, SR Medición de viabilidad de Hpc: azul tripán versus naranja de acridina y yoduro de propidio. Transfus 40, 693–696. https://doi.org/10.1046/j.1537-2995.2000.40060693.x (2000).

Artículo CAS Google Scholar

Tennant, J. Evaluación de la técnica del azul tripán para la determinación de la viabilidad celular. Trasplante 2, 686–694 (1964).

Artículo de Google Scholar

Chan, LL, Rice, W. & Qiu, J. Observación y cuantificación del efecto morfológico del azul tripán al romper células muertas o moribundas. MÁS UNO 15, 66. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227950 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Mernier, G., Piacentini, N., Tornay, R., Buffi, N. y Renaud, P. Evaluación de la viabilidad celular mediante citometría de flujo utilizando levadura como modelo celular. Sens. Actuadores B Chem. 154, 160–163. https://doi.org/10.1016/j.snb.2009.11.066 (2009).

Artículo CAS Google Scholar

Cheong, FC y cols. Visualización de flujo y citometría de flujo con videomicroscopía holográfica. Optar. expreso 17, 13071–13079. https://doi.org/10.1364/OE.17.013071 (2009).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Midtvedt, D., Olsen, E., Hook, F. y Jeffries, GD Monitoreo espacio-temporal sin etiquetas de la masa citosólica, la osmolaridad y el volumen en células vivas. Nat. Comunitario. 10, 66. https://doi.org/10.1038/s41467-018-08207-5 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

Gorbenko, D. y col. Cuantificación de cambios en la morfología celular durante la necrosis celular obtenidos a partir de distribuciones de índice de refracción 3D. J. Phys.: Conf. Ser. 1236, 012015. https://doi.org/10.1088/1742-6596/1236/1/012015 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

Rommel, CE y cols. Imágenes holográficas digitales con contraste mejorado de estructuras celulares mediante la manipulación del índice de refracción intracelular. J. Biomed. Optar. 15, 1–10. https://doi.org/10.1117/1.3449567 (2010).

Artículo de Google Scholar

Cheong, FC y cols. Seguimiento rápido y de alto rendimiento de la motilidad bacteriana en 3D mediante microscopía de vídeo holográfica de contraste de fase. Biofísica. J. 108, 1248-1256. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2015.01.018 (2015).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Feizi, A. y col. Análisis de concentración y viabilidad de células de levadura rápido, portátil y rentable mediante microscopía en chip sin lentes y aprendizaje automático. Chip de laboratorio https://doi.org/10.1039/C6LC00976J (2016).

Artículo PubMed Google Scholar

Rappaz, B., Breton, B., Shaffer, E. y Turcatti, G. Microscopía holográfica digital: una técnica de microscopía cuantitativa sin etiquetas para la detección fenotípica. Combinar. Química. Pantalla de alto rendimiento. 14, 66. https://doi.org/10.2174/13862073113166660062 (2013).

Artículo CAS Google Scholar

Bélanger, E., Lévesque, SA, Rioux-Pellerin, A., Lavergne, P. & Marquet, P. Medición del volumen celular absoluto mediante microscopía holográfica digital de fase cuantitativa y un sistema de bajo costo, de código abierto e impreso en 3D cámara de flujo. Frente. Física. 7, 172. https://doi.org/10.3389/fphy.2019.00172 (2019).

Artículo de Google Scholar

Ugele, M. et al. Detección de alto rendimiento y sin etiquetas de p. falciparum en eritrocitos esféricos con microscopía holográfica digital. Chip de laboratorio 18, 66. https://doi.org/10.1039/C8LC00350E (2018).

Artículo de Google Scholar

Mugnano, M. et al. Evaluación de citotoxicidad in vitro del cadmio mediante microscopía holográfica sin etiquetas. J. Biofotón. 11, e201800099. https://doi.org/10.1002/jbio.201800099 (2018).

Artículo CAS Google Scholar

Kastl, L., Isbach, M., Dirksen, D., Schnekenburger, J. y Kemper, B. Imágenes de fase cuantitativa para el control de calidad de cultivos celulares: control de calidad de cultivos celulares sin etiquetas. Citomo. A 91, 66. https://doi.org/10.1002/cyto.a.23082 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Min, J. y col. Imágenes de fase cuantitativa de células en una disposición de citometría de flujo que utiliza microscopía holográfica digital fuera de eje basada en interferómetro de Michelson. J. Biofotón. 12, 66. https://doi.org/10.1002/jbio.201900085 (2019).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Eder, KM et al. Microscopía holográfica digital sin etiquetas para la cuantificación del efecto citotóxico in vitro de nanopartículas orgánicas. Celdas 11, 66. https://doi.org/10.3390/cells11040644 (2022).

Artículo CAS Google Scholar

Kühn, J. et al. Ensayo de detección de citotoxicidad sin etiquetas mediante microscopía holográfica digital. Desarrollo de fármacos de ensayo. Tecnología. 11, 101-107. https://doi.org/10.1089/adt.2012.476 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Makdasi, E. y col. Ensayo multiparamétrico de células completas para microscopía holográfica digital basada en la actividad de ricina y abrina. Toxinashttps://doi.org/10.3390/toxins11030174 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Pratt, PL, Bryce, JH y Stewart, GG Los efectos de la presión osmótica y el etanol sobre la viabilidad y morfología de la levadura. J.Inst. Elaborar cerveza. 109, 218–228 (2003).

Artículo CAS Google Scholar

Odumeru, JA, D'Amore, T., Russel, I. y Stewart, GG Efectos del choque térmico y el estrés por etanol sobre la viabilidad de una cepa de levadura cervecera Saccharomyces uvarum (carlsbergensis) durante la fermentación de mosto de alta gravedad. J. Ind. Microbiol. 10, 111-116 (1992).

Artículo de Google Scholar

Gabor, D. Un nuevo principio microscópico. Naturaleza 161, 777–778. https://doi.org/10.1038/161777a0 (1948).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Sheng, J., Malkiel, E. & Katz, J. Microscopio holográfico digital para medir movimientos y distribuciones de partículas tridimensionales. Aplica. Optar. 45, 3893–3901. https://doi.org/10.1364/AO.45.003893 (2006).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Lee, S.-H. et al. Caracterización y seguimiento de partículas coloidales individuales con microscopía holográfica de vídeo. Optar. Expreso 15, 18275–18282. https://doi.org/10.1364/OE.15.018275 (2007).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Cheong, FC, Krishnatreya, BJ y Grier, DG Estrategias para el seguimiento de partículas tridimensionales con microscopía de video holográfica. Optar. Expreso 18, 13563–13573. https://doi.org/10.1364/OE.18.013563 (2010).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Perry, R., Meng, G., Dimiduk, T., Fung, J. y Manoharan, V. Estudios en el espacio real de la estructura y dinámica de grupos coloidales autoensamblados. Faraday discutir. 159, 66. https://doi.org/10.1039/c2fd20061a (2012).

Artículo CAS Google Scholar

Wang, A. y col. Uso de la aproximación dipolar discreta y microscopía holográfica para medir la dinámica rotacional de coloides no esféricos. J. Cuant. Espectrosc. Radiación. Transf.https://doi.org/10.1016/j.jqsrt.2013.12.019 (2013).

Artículo de Google Scholar

Schnars, U. & Jüptner, W. Grabación directa de hologramas mediante un objetivo ccd y reconstrucción numérica. Aplica. Optar. 33, 179–81 (1994).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Cuche, E., Marquet, P. & Depeursinge, C. Microscopía simultánea de contraste de amplitud y contraste de fase cuantitativa mediante reconstrucción numérica de hologramas fuera del eje de Fresnel. Aplica. Optar. 38, 6994–7001. https://doi.org/10.1364/AO.38.006994 (2000).

ADS del artículo Google Scholar

Ovryn, B. & Izen, S. Imágenes de esferas transparentes a través de una interfaz plana utilizando un microscopio óptico de alta apertura numérica. J. Optar. Soc. Soy. Una opción. Ciencia de la imagen. Visión 17, 1202–13. https://doi.org/10.1364/JOSAA.17.001202 (2000).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Xu, W., Jericho, M., Meinertzhagen, I. y Kreuzer, H. Holografía digital en línea de microesferas. Aplica. Optar. 41, 5367–75. https://doi.org/10.1364/AO.41.005367 (2002).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Bohren, CF y Huffman, DR Absorción y dispersión de luz por partículas pequeñas (Wiley, Nueva York, 1983).

Google Académico

Mishchenko, MI, Travis, LD y Lacis, AA Dispersión, absorción y emisión de luz por partículas pequeñas (Cambridge University Press, 2001).

Gouesbet, G. y Grehan, G. Teorías generalizadas de Lorenz-Mie (Springer, 2011).

Philips, L. y col. Caracterización holográfica de contaminantes en agua: Diferenciación de partículas suspendidas en dispersiones heterogéneas. Agua Res. 122, 66. https://doi.org/10.1016/j.watres.2017.06.006 (2017).

Artículo CAS Google Scholar

Odete, MA et al. El papel del medio en la interpretación de la esfera efectiva de los datos de caracterización de partículas holográficas. Materia blanda https://doi.org/10.1039/c9sm01916b (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Cheong, FC, Xiao, K., Pine, D. y Grier, D. Caracterización holográfica de las porosidades de esferas coloidales individuales. Materia blanda 7, 6816–6819. https://doi.org/10.1039/C1SM05577A (2011).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Markel, VA Introducción a la aproximación de Maxwell Garnett: Tutorial. J. Optar. Soc. Soy. Una opción. Ciencia de la imagen. Vis. 33, 1244-1256. https://doi.org/10.1364/JOSAA.33.001244 (2016).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Inviernos, A. et al. Diferenciación cuantitativa de agregados proteicos de otras partículas subvisibles en mezclas viscosas mediante caracterización holográfica. J. Farmacéutica. Ciencia.https://doi.org/10.1016/j.xphs.2020.05.002 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, C. y col. Caracterización holográfica de agregados fractales coloidales. Materia blanda 12(42), 8774–80. https://doi.org/10.1039/c6sm01790h (2016).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Altman, LE, Quddus, R., Cheong, FC y Grier, DG Caracterización holográfica y seguimiento de dímeros coloidales en la aproximación de esfera efectiva. Materia blanda https://doi.org/10.1039/D0SM02262D (2021).

Artículo PubMed Google Scholar

Ruffner, D., Cheong, FC, Blusewicz, J. y Philips, L. Levantamiento de la degeneración en la caracterización holográfica de partículas coloidales mediante imágenes multicolores. Optar. Expreso 26, 13239. https://doi.org/10.1364/OE.26.013239 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nakao, S., Kojima, K. y Sudo, Y. Muerte celular apoptótica fotoactivada (pta) utilizando la bomba de protones hacia afuera impulsada por luz rodopsina arquerodopsina-3. Mermelada. Química. Soc. 144, 3771–3775. https://doi.org/10.1021/jacs.1c12608 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Young, KD Por qué muere la Escherechia coli esférica: la historia interna. J. Bacteriol. 190, 1497–1498. https://doi.org/10.1128/JB.01975-07 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kasimbeg, PN, Cheong, FC, Ruffner, DB, Blusewicz, JM & Philips, LA Caracterización holográfica de agregados proteicos en presencia de aceite de silicona y tensioactivos. J. Farmacéutica. Ciencia. 108, 155-161. https://doi.org/10.1016/j.xphs.2018.10.002 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Wang, C. y col. Caracterización holográfica de agregados proteicos. J. Farmacéutica. Ciencia. 105, 1074–1085. https://doi.org/10.1016/j.xphs.2015.12.018 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gibson, BR, Lawrence, SJ, Leclaire, JPR, Powell, CD y Smart, KA Respuestas de la levadura al estrés asociado con el manejo de cervecerías industriales. Microbiol FEMS. Apocalipsis 31, 535–569. https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2007.00076.x (2007).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Hohmann, S. y Mager, W. Respuestas al estrés de las levaduras (Springer, 2003).

Descargar referencias

La investigación presentada en esta publicación fue financiada en parte por el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales de los Institutos Nacionales de Salud con el número de premio R44TR001590. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no necesariamente representa las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Estos autores contribuyeron igualmente: Rostislav Boltyanskiy y Mary Ann Odete.

Spheryx, Inc., Nueva York, NY, 10016, EE. UU.

Rostislav Boltyanskiy, Mary Ann Odete, Fook Chiong Cheong y Laura A. Philips

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

LAP y FCC concibieron los experimentos, RB, MAO y FCC los llevaron a cabo. Todos los autores analizaron los resultados y revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Rostislav Boltyanskiy.

Todos los autores son empleados de Spheryx, Inc., el fabricante de xSight y xCells que se utilizaron para realizar la investigación que se informa en esta publicación.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Boltyanskiy, R., Odete, MA, Cheong, FC et al. Ensayo de viabilidad sin etiquetas mediante microscopía de vídeo holográfica en línea. Informe científico 12, 12746 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17098-y

Descargar cita

Recibido: 29 de noviembre de 2021

Aceptado: 20 de julio de 2022

Publicado: 26 de julio de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17098-y

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, actualmente no hay un enlace para compartir disponible para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenidos Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.